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液相色譜法檢測罐裝食品中類雌激素雙酚A和烷基酚

　　近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對生態(tài)環(huán)境的不良影響已引起人們廣泛的關(guān)注。其中壬基酚(nonylphenol，NP)、辛基酚(octylphenol，OP)和雙酚A(bisphenol A，BPA)已在眾多的體外試驗和體內(nèi)實驗中被證實對動物具有潛在的雌激素效應(yīng)。隨著工業(yè)化的發(fā)展，壬基酚、辛基酚和雙酚A的廣泛使用，可以通過食物或生物鏈進(jìn)入動物和人體內(nèi)，對人類健康構(gòu)成較大的威脅，最終危害人體健康。因此，建立一套科學(xué)檢測壬基酚、辛基酚和雙酚A的方法，正確評估壬基酚、辛基酚和雙酚A危險性十分必要。

　　國內(nèi)外的分析工作者針對OP、NP、BPA的檢測研究了許多方法，使用最廣泛的檢測技術(shù)是色譜法，主要是氣相色譜法、氣相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 刮液相色譜法、液一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)5-7，本研究用液液萃取、固相萃取(SPE)等前處理方法，結(jié)合高壓液相色譜法(HPLC)一熒光檢測手段，建立檢測食品中NP、OP和BPA的方法。

　　材料與方法

　　一、實驗材料

　　1.儀器：分析天平(SARTURIUS公司，美國)，超聲波清洗器(Elma公司，德國)，氮吹儀(EYELA公司，美國)，液相色譜儀(LC7000，濟(jì)南海能儀器)。所有玻璃器皿、用具采用重鉻酸鉀洗液浸泡3—8 h再經(jīng)超純水清洗，或經(jīng)過400 cc高溫烘烤4 h處理，以避免過程中引入干擾。

　　2.試劑和標(biāo)準(zhǔn)品：雙酚A(純度>99.0% ，東京化成工業(yè)株式會社)，壬基酚(純度>99.0% ，東京化成工業(yè)株式會社)，辛基酚(純度>99.0% ，Ehrenstorfer GmbH公司，德國)，甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)，二氯甲烷(色譜純，F(xiàn)isher公司)，丙酮(色譜純，F(xiàn)isher公司)，鹽酸(優(yōu)級純，北京化工廠)，乙醚(優(yōu)級純，北京化工廠)，氫氧化鈉(分析純，北京化工二廠)，NH，固相萃取(SPE)柱(Waters公司，美國)。

　　雙酚A標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：準(zhǔn)確稱取10 mg雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇中并定容至10 ml，保存于冰箱4 cc中備用。壬基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：準(zhǔn)確稱取10 mg壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇中并定容至10ml，保存于冰箱4 cc中備用。辛基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：準(zhǔn)確稱取10 mg辛基酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇中并定容至10 ml，保存于冰箱4 cc中備用。壬基酚、辛基酚、雙酚A混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：精密吸取上述壬基酚、辛基酚、雙酚A標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇配制使壬基酚、辛基酚、雙酚A含鞋分別為1ug/L、1ug/L、1ug/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，保存于冰箱4度中備用。

　　二、實驗方法

　　1.樣品處理：(1)液液萃�。喝悠�10 g，加入硅藻土30 g，用甲醇25 ml超聲提取30 min，提取3次，過濾，取濾液蒸發(fā)溶劑至近于，用20 ml氫氧化鈉(1 mol/L)溶解，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 m1分液漏斗中。濾液用12 mol/L HC1酸化至pH=2～3，加10 ml二氯甲烷振蕩萃取，分出有機(jī)層，重復(fù)萃取3次，合并有機(jī)層。過無水硫酸鈉后，于40 qC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干，上柱。(2)SPE萃�。簩⑸鲜鰵堅枚燃淄槿芙猓尤氲教幚砗玫腘H柱[用10 ml甲醇一丙酮(50：50)，5 ml正己烷淋洗活化的NH 柱]用5 ml正己烷淋洗NH 柱，真空泵將SPE柱殘留的液體抽去，接下來用10 ml甲醇一丙酮(50：50)洗脫。將洗脫液用氮?dú)獯蹈�，然后用甲醇定容�? ml，用于HPLC分析。

　　2.液相色譜參考條件：(1)色譜柱：C18(3.5 um，2.1×150 mm)。(2)柱溫：25 cc。(3)熒光檢測器的激發(fā)波長：225 nm;發(fā)射波長：310 nm。(4)流動相為甲醇和水：梯度洗脫程序：55%甲醇7 min內(nèi)線性增加到70%甲醇，再于1 min內(nèi)線性增加到80% 甲醇，保持30 min，然后在1 min內(nèi)線性降低到55%甲醇，保持11 min，等待進(jìn)樣。(5)流速0.15 ml/min。

　　3.測定：在相同的液相色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

　　結(jié) 果

　　方法學(xué)參數(shù)

　　1.線性范圍：精密吸取壬基酚、辛基酚、雙酚A混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，加甲醇配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0ug/L不同濃度的BPA、NP、OP的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，各進(jìn)樣10 l，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積值為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，BPA、NP和OP的相關(guān)系數(shù)(R )分別為0.9998、0.9985和0.9988;回歸方程分別為】，=723X一1.83×10 、Y=1060X一1.27×10 和】，=1710X一2.73×10’。在0.1～0.2 g/L范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

　　2.檢出限和定量限：采用峰高計算噪音水平和分析物信號，以信噪比3的濃度作為檢測限(LOD)，結(jié)果蔬菜類罐裝食品和方便面BPA、NP和OP的檢出限為0.5、0.1和0.1ug/kg，魚、肉類罐裝食品BPA、NP和OP的檢出限為1、0.5和0.5ug/kg。

　　3.準(zhǔn)確度：蔬菜類罐裝食品和方便面BPA、NP和OP的檢出限為0.5、0.1和0.1 g/kg，魚、肉類罐裝食品BPA、NP和OP的檢出限為l、0.5和0.5 g/kg。BPA、NP和OP加標(biāo)回收率分別為74.9% ～95.1% 、76.3% ～103.6% 和72.1% ～109.2% ;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.98% ～1 1.2% 、2.35% ～8.88% 和5.61% ～12.3% 。采集不同種類罐裝食品，進(jìn)行BPA、NP、OP的加標(biāo)試驗。按10 g樣品分別加入l0、50和100 ng3個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析方法如實驗部分中所述(n=5)。實驗結(jié)果如下：蔬菜罐頭食品BPA、NP、OP的加標(biāo)回收率分別為81.2% ～90.2%、85.1% ～91.2% 、80.2% ～85.5% ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.6l% ～8.19% 、2.35% ～5.55% 、5.61% ～8.61%;方便面食品BPA、NP、OP的加標(biāo)回收率分別為83.5% ～95.1% 、89.6% ～95.4% 、80.6% ～84.6% ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.98% ～8.79% 、3.11% ～6.22% 、6.38% ～9.05% ;魚罐頭食品BPA、NP、OP的加標(biāo)回收率分別為74.9% ～80.1% 、80.1% ～103.6% 、75.5% ～102.1% ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.22% ～ 11.2% 、6.54% 一8.88% 、10.2% ～12.3%;肉類罐頭食品BPA、NP、OP的加標(biāo)回收率分別為78。1% ～ 81.3% 、76.3% ～ 86.1% 、72.1% ～109.2% ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.55 D/c～10.5% 、7.12% ～ 8.56% 、9.98% ～ 11.5% 。BPA 、NP和OP回收率均符合歐盟指令2001/22/EC對加標(biāo)回收率的要求(70% ～110%)。圖1為標(biāo)準(zhǔn)混合物、試樣及其加標(biāo)回收的典型色譜圖。

　　圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合物、試樣及其加標(biāo)回收的典型色譜圖

　　4.精密度：取試樣照上述測定方法，重復(fù)測定5次，BPA、NP和OP的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為7.9% ～16.2% 、9.8% ～12.6% 和3.0% ～17.5% ，均滿足痕量分析對精密度的要求。

　　二、試樣含量測定

　　對市售的魚、蔬菜、肉類罐裝食品及方便面按上述方法進(jìn)行處理，精密吸取試樣溶液，按上述色譜參數(shù)和條件，每個試樣平行測定2次，取平均值。按校正曲線法計算各試樣中的含量，測定結(jié)果見表1。

　　討論

　　提取條件的優(yōu)化

　　1.提取溶液的選擇：實驗中比較了正己烷、乙醚、二氯甲烷、甲醇等溶劑的超聲提取效果，結(jié)果表明甲醇、二氯甲烷提取效果較好，但二氯甲烷毒性較大，故采用甲醇提取。由于烷基酚是具有酚羥基的化合物，顯弱酸性，可溶于堿性溶液中。筆者將烷基酚(BPA、OP、NP)溶于氫氧化鈉溶液中，用鹽酸(pH：3)酸化，使烷基酚(BPA、OP、NP)游離，用二氯甲烷萃取。實驗中比較了正己烷、乙醚、二氯甲烷等溶劑的萃取效果，這些萃取溶液對待測物質(zhì)的回收率分別為正己烷71.2% ～80.5% ，乙醚75.6% ～85.8% 、二氯甲烷85.5% ～104.9% ，結(jié)果表明二氯甲烷的萃取率最高，因此選用二氯甲烷作為萃取劑。

　　2.實驗比較了在pH=3、pH=5條件下的萃取率，結(jié)果表明，在pH=3的條件下萃取率較高，故選萃取pH值為3。

　　2.SPE萃取方法的優(yōu)化(固相萃取柱及洗脫劑的選擇)：由于食品樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，雖然經(jīng)過上述液液萃取凈化，但仍有雜質(zhì)干擾，需進(jìn)一步進(jìn)行SPE萃取凈化。上述液液萃取是采用二氯甲烷作為萃取劑，所以考慮使用正相萃取柱。據(jù)文獻(xiàn)報道 J，N柱、NH 柱和硅膠柱對樣品的凈化和對待測物質(zhì)的保留的研究情況表明，CN柱除了對BPA有較高的回收率外，對NP、OP和4-n—NP的保留都相對較差;而硅膠柱去除脂肪的效果較差;NH，柱除了具有較好的去除脂肪效果外，對待測物質(zhì)的回收率也十分理想，因此本實驗選擇了NH 柱作為固相萃取柱，而且獲得了較好的回收率。將清洗液通過之前用10 ml甲醇一丙酮(50：50)淋洗，5 ml正己烷活化的NH：柱，之后再用5 ml正己烷淋洗NH 柱，再用1O ml甲醇一丙酮(50：50)洗脫。正己烷可除去極性小的脂肪、油脂成分。NP和OP的極性較低，BPA的極性相對較高。單純使用甲醇或丙酮無法洗脫目標(biāo)化合物，當(dāng)甲醇一丙酮(50：50)溶液洗脫SPE柱，所得結(jié)果最理想。

　　二、色譜條件的優(yōu)化

　　1.色譜柱的選擇：目前采用液相色譜方法對BPA、OP和4-NP分析時，基本采用反相色譜，流動相以甲醇一水、乙腈一水體系為主，適當(dāng)調(diào)節(jié)酸度，調(diào)節(jié)酸度所用的酸主要是乙酸或使用緩沖鹽溶液。本實驗分別考察了不同色譜柱c c 和苯基柱對BPA、OP和4一NP的分離效果，結(jié)果表明，使用c。(載體粒度為5 m)、C 和苯基柱時，BPA基線分離，峰形對稱，OP、NP分離效果不好。使用WatersXTerra@ MS C】8(載體粒度為3.5 m)時，BPA、OP、NP基線分離，峰形對稱，分離效果較好。此外，本實驗研究表明若在流動相中加入乙酸、三乙胺等調(diào)節(jié)pH值，OP、NP峰形變胖，分離效果并不理想。

　　2.流動相的選擇：本實驗采用Waters XTerraⅢMS C18液相色譜柱分離，考察不同比例甲醇一水、乙腈一水作為流動相梯度洗脫的效果。結(jié)果表明，甲醇一水作為流動相的分離效果明顯好于乙腈一水作為流動相的分離效果。當(dāng)以甲醇一水作為流動相，梯度洗脫時，分離效果較好。

　　3.柱溫的選擇：比較柱溫為25、3O、4O℃ 時對OP、4-NP和BPA分離和色譜峰形，結(jié)果表明，溫度升高，保留時間減小，分離效果和色譜峰形無明顯改變，故選擇25℃作為檢測溫度。

　　4.其他影響因素：由于SPE柱容量較小，柱長較短，因此為了保證較高的洗脫能力，甲醇、水淋洗和乙醚洗脫時，應(yīng)將流出的速度控制在2～3 ml/min，而不能采用抽真空的方式，否則洗脫效果較差，需要增加洗脫劑的用量。

　　此方案建立了罐裝食品中類雌激素(NP、OP和BPA)的HPLC一熒光測定方法。方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足痕量分析的要求，該方法具有簡便、快速的優(yōu)點。

液相色譜法檢測罐裝食品中類雌激素雙酚A和烷基酚

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