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液相色譜法對(duì)牛、豬肌肉和腎臟中頭孢噻呋殘留量的測(cè)定研究

液相色譜法對(duì)牛、豬肌肉和腎臟中頭孢噻呋殘留量的測(cè)定研究

　　頭孢噻呋(ceftiofur)是第一個(gè)動(dòng)物專用的頭孢菌素類抗生素，主要用于生畜呼吸道疾病的治療。如果獸藥不合理使用，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物性食品藥物殘留超標(biāo)，長(zhǎng)期食用可引起細(xì)菌耐藥性，造成人體微生物環(huán)境紊亂和失調(diào)。頭孢噻呋在體內(nèi)迅速代謝為脫呋喃甲酸頭孢噻呋(desfuroylecefliofur，DFC)和呋喃甲酸(furoic acid)，其中DFC為標(biāo)志性殘留物 。目前，歐盟和加拿大等一些發(fā)達(dá)國(guó)家規(guī)定頭孢噻呋及其代謝物在動(dòng)物組織中的最大殘留限量(MRL)：肌肉1 000 g/kg、腎6 000 g/kg。

　　頭孢噻呋殘留量的檢測(cè)方法有微生物檢測(cè)法、免疫分析法和液相色譜法 。微生物法樣品處理簡(jiǎn)單、回收率較高，但不易篩選到特別敏感的菌株，缺乏特異性，而且多數(shù)分析周期較長(zhǎng)。免疫分析法靈敏度高，特異性比微生物法強(qiáng)，適合于大量樣品的快速篩選。液相色譜法(HPLC)是已報(bào)道用于頭孢噻呋殘留檢測(cè)最常用的檢測(cè)方法 。液相色譜一質(zhì)譜法(LC—MS)可用于殘留確證分析 ，但所用儀器要求高、價(jià)格昂貴。本文采用HPLC/UV法測(cè)定牛、豬肌肉和腎臟中的頭孢噻呋相關(guān)殘留量。與Jacobson等不同，采用多個(gè)固相萃取柱凈化樣品，雖然增加了操作步驟，但大大消除了樣品基體對(duì)被測(cè)物的影響，檢出限更低，且方法的回收率和精密度均較好。

　　1 實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1 儀器與試劑

　　海能LC7000高效液相色譜系統(tǒng)，LC7011泵體，LC7020紫外一可見光檢測(cè)器，LC7050自動(dòng)進(jìn)樣器，配HanonClarity色譜軟件。AutoSPE固相萃取裝置。C18 固相萃取柱(500 mg，Va6an公司)，使用前用4 mL甲醇和5 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液淋洗活化。SAX固相萃取柱(500 mg，Vafian公司)，使用前依次用2 mL甲醇、2 mL甲醇一0.1 mol/L氯化鈉(體積比25：75)和2 mL水淋洗活化。SCX固相萃取柱(100 mg，Varian公司)，使用前依次用1 mL甲醇、2 mL甲醇一0.1 moL/L氯化鈣(體積比25：75)和4 mL水淋洗活化。頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品(純度96.0% ，Dr.Ehrenstorfer公司);二硫赤蘚糖醇(純度99% ，Sigma公司);碘乙酰胺(純度97% ，Sigma公司);三氟乙酸(純度97%);乙腈、甲醇(色譜純);其他試劑為分析純，水由Milli Q凈化系統(tǒng)(Millipore公司)制得。

　　1.2 溶液配制

　　頭孢噻呋儲(chǔ)備液(100 mg/L)：稱取10.0 mg頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，一20℃保存，可使用6個(gè)月。頭孢噻呋中間液(5 mg/L)：吸取250 L 100 mg/L頭孢噻呋儲(chǔ)備液至5 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)定容，搖勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)。0.025 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)：將3.4 g磷酸二氫鉀溶于900 mL水中，用450 g/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用水定容至1 L。0.05 mol/L硼酸緩沖液：稱取19 g硼酸鈉和3.7 g氯化鉀，用水定容到1 L;4 g/L二硫赤蘚糖醇溶液：稱取1.0 g二硫赤蘚糖醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用);40 g/L碘乙酰胺溶液：稱取2.0 g碘乙酰胺，溶于50 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

　　1.3 色譜條件

　　C 柱(250 mm×4.6 mm，5 I.Lm);流動(dòng)相：乙腈一水一三氟乙酸(體積比15：85：0.1);流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃ ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm;進(jìn)樣量：25 L。

　　1.4 樣品處理

　　1.4.1 提取與衍生稱取1.0 g組織樣品于50 mL離心管中，加入14 mL 4 g/L二硫赤蘚糖醇溶液，均質(zhì)，然后放入恒溫振蕩水槽儀中37℃保溫20 min。加入3 mL 4%碘乙酰胺溶液，搖勻，室溫下靜置衍生30 min，離心10 min(4℃，20 000 r/min)，取出上清液于25 mL比色管中。殘?jiān)�中加�? mL0.025 mol/L磷酸緩沖液，混勻，離心10 min(4℃，20 000 r/min)，合并上清液，用25%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5～2.6，用水定容至25 mL。取出10.0 mL定容液，離心15 min(4℃ ，20 000 r/min)。

　　1.4.2 凈化將“1.4.1”最后所得的上清液過(guò)C 固相萃取柱，保持流速1～2 mL/min，再依次用5mL磷酸緩沖液和3 mL 0.01 moL/L氫氧化鈉溶液淋洗，用2 mL乙腈一水(體積比15：85)洗脫并收集于含5 mL水的試管中，保持抽真空2 min。取出收集的試管，加入5 mL水，搖勻，過(guò)SAX固相萃取柱，保持流速1～2 mL/min，用1 mL水潤(rùn)洗試管，加入柱中，用2.5 mL乙腈一體積分?jǐn)?shù)為5% 乙酸(體積比5：95)洗脫并收集于另一含5 mL水的試管中，保持抽真空2 min。取出收集的試管，加入5mL水，搖勻，過(guò)SCX固相萃取柱，保持流速1～2 mL/min，用1 mL水潤(rùn)洗試管，加入柱中，用2.5mL乙腈一0.1 mol/L氯化鈉(體積比5：95)洗脫并收集，保持抽真空2 min。取出收集的試管，搖勻，供測(cè)定。

　　1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品處理移取適量頭孢噻呋中間液至50 mL離心管，加入14 mL 4 g/L二硫赤蘚糖醇溶液，然后放入恒溫振蕩水槽儀中37℃保溫20 min。加入3 mL 40 g/L碘乙酰胺溶液，搖勻，室溫下靜置衍生30 min，加入6 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液，用25%(體積分?jǐn)?shù))磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5～2.6，用水定容樣液至25 mL。其余操作步驟同“1.4.2”節(jié)。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 衍生化

　　頭孢噻呋在動(dòng)物體內(nèi)主要以脫呋喃甲酸頭孢噻呋(DFC)代謝物存在，DFC可與體內(nèi)生物大分子(如血漿蛋白)結(jié)合。結(jié)合態(tài)的DFC不容易被水性溶液提取，因此要將結(jié)合態(tài)變成游離態(tài)。二硫赤蘚糖醇可以把蛋白結(jié)合的DFC及母體藥轉(zhuǎn)化為DFC，游離的DFC與碘乙酰胺反應(yīng)，生成具有紫外吸收的衍生物脫呋喃甲酸頭孢噻呋乙酰胺(DCA)。

　　2.2 凈化條件的選擇

　　提取、衍生后的樣液凈化采用C 柱、SAX陰離子交換柱和SCX陽(yáng)離子交換柱3種不同的固相萃

　　取柱。C 柱主要去除中性雜質(zhì)，SAX柱主要去除陽(yáng)離子化合物，SCX柱主要去除陰離子化合物。本實(shí)驗(yàn)考察了1根柱(C 柱)、2根柱(C 柱和SAX柱)和3根柱(C 柱、SAX柱和SCX柱)的凈化效果，發(fā)

　　現(xiàn)單獨(dú)使用C 柱和使用C 與SAX柱的凈化效果均不理想，樣液中其它組分對(duì)測(cè)定有干擾。同時(shí)使用3根固相萃取柱，凈化和富集效果較好(見圖1)。

　　固相萃取柱的上樣量對(duì)柱子的提取和凈化有影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果樣液(25 mL)全部過(guò)柱，高濃度添加樣品的回收率偏低，表明柱容量過(guò)載，有部分待測(cè)物流失。分取部分樣液(10 mL)過(guò)柱，回收率明顯提高，即使在高濃度時(shí)，也能滿足定量檢測(cè)的要求。

　　2.3 流動(dòng)相的選擇

　　流動(dòng)相采用乙腈一水(該體系均含0.1%TFA)或甲醇一水(含0.1% TFA)體系，發(fā)現(xiàn)乙腈一水體

　　系優(yōu)于甲醇一水體系。以乙腈一水(體積比10：90)和乙腈一水(體積比90：10)進(jìn)行梯度洗脫，或以乙腈一水(體積比15：85)等度洗脫，頭孢噻呋衍生物(DCA)的分離效果都比較好，樣液中的其他組分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。由于梯度洗脫進(jìn)樣前需要平衡，分析時(shí)間較長(zhǎng)，故選擇等度洗脫。流動(dòng)相中乙腈比例增加，頭孢噻呋衍生物(DCA)出峰提前，但分離度變差。

　　2.4 頭孢噻呋衍生物的穩(wěn)定性

　　對(duì)1.28 mg/L頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品衍生物(DCA)作穩(wěn)定性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)衍生物在4℃、避光條件下保存1個(gè)月，峰面積與剛衍生完時(shí)的峰面積幾乎一致。

　　2.5 線性范圍與檢出限

　　在質(zhì)量濃度0.016～1.28 mg/L(相當(dāng)于添加量為100—8 000 kg)范圍內(nèi)，峰面積(y)與質(zhì)量濃度( x)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為Y=5.016 7 +139.3，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999 9。根據(jù)3倍信噪比確定檢出限為50 ug/kg。

　　本實(shí)驗(yàn)以4種動(dòng)物性產(chǎn)品(牛腎、牛肉、豬腎、豬肉)作為樣本。取適量標(biāo)準(zhǔn)品加入到1.0 g樣品中，使添加量在牛腎和豬腎中相當(dāng)于200、6 000和8 000ug/kg，在牛肉和豬肉中相當(dāng)于200、1 000和2 000ug/kg，每個(gè)添加水平各取24份試樣，按“1.4.1～1.4.2”節(jié)所述步驟進(jìn)行處理，加標(biāo)平均回收率為90%～91% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)1.8%～3.5% ，結(jié)果滿意。

　　本方法經(jīng)8家實(shí)驗(yàn)室的協(xié)同試驗(yàn)，腎臟樣品添加量在200、6 000和8 000ug/kg和肌肉樣品添加量在200、1 000和2 000ug/kg時(shí)(每個(gè)添加量單獨(dú)測(cè)定2次)，測(cè)得實(shí)驗(yàn)室間平均回收率為88%～91% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～6.1% 。

　　2.7 應(yīng) 用

　　取陽(yáng)性樣品牛腎和牛肉按“1.4”步驟進(jìn)行處理和測(cè)定，由結(jié)果知，樣品中其它組分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，據(jù)處理功能(間隔為0.5 nm)和Origin 7.5求積分功能，得到J=5.2×10-15 cm3·L ·mol-1;再由(2)式求出 值。一般認(rèn)為藥物對(duì)BSA的熒光猝滅作用主要源于212位色氨酸殘基。當(dāng)c(E)：c(BSA)=1：1(相對(duì)分子質(zhì)量以2 000計(jì))時(shí)，E=1一， / =0.13，由(1)式求出R0值，得r=2.15 nm。