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液相色譜法測(cè)定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

液相色譜法測(cè)定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

　　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族毒素。主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生。DON污染糧谷的情況非常普遍。世界各地均有報(bào)道，特別在中國(guó)、日本、美國(guó)、阿根廷和南非。在我國(guó)胃癌、食管癌等惡性腫瘤高發(fā)區(qū).DON是居民飲食中主要的污染霉菌毒素之一。DON主要在田間侵染小麥、玉米等谷類作物，當(dāng)人攝入了被DON污染的食物后。會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。

　　DON化學(xué)名稱為3，7，15一三羥基一12，13一環(huán)氧單端孢霉一9一烯一8一酮，為無(wú)色針狀晶體。熔點(diǎn)為151。153℃。其化學(xué)性能非常穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的熱抵抗力和耐酸性.在pH值10.O條件下。100℃加熱60min部分被破壞，120℃加熱30 min和170℃加熱15 min完全被破壞【”。目前，測(cè)定糧谷作物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法很多，如薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。本文采用了液相色譜法，使用海能LC7000液相色譜儀配紫外檢測(cè)器和C18親水性分離柱，不僅獲得了準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果.而且極大地提高了工作效率。

　　l 材料與方法

　　1.1儀器

　　海能LC7000液相色譜儀(配備紫外檢測(cè)器)，7mILOGY嘔吐毒素專用凈化柱TC—T200，C18親水性分離柱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高速均質(zhì)機(jī)，真空泵，小型粉碎機(jī)。

　　1.2試劑

　　乙腈(Merck，色譜純)，甲醇(Merck，色譜純)，嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品(FERMENTEK LTD)。

　　1.3 操作步驟

　　(1)提取稱取粉碎過(guò)篩樣品25.O g于均質(zhì)杯中，加入100 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液，于高速均質(zhì)機(jī)上均質(zhì)4 min，靜置。

　　(2)凈化濃縮取2 mL樣品提取液上清液到凈化小柱頂端，向下推活塞，使溶液全部過(guò)柱，收集凈化后溶液放入100 mL標(biāo)準(zhǔn)磨口蒸發(fā)瓶中.取出注射器，加入8 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液到柱頂端，將溶液徹底過(guò)柱，合并凈化液，于60℃減壓蒸干。用2 mL流動(dòng)相定容。

　　1.4測(cè)定

　　色譜條件：C18親水性分離柱(250×4.6 mill，5斗m)，柱溫箱40℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)220 nm，流動(dòng)相：y(水)：y(甲醇)：y(乙腈)=92：4：4，流速1.5 mL/rain，進(jìn)樣量20斗L。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：使DON質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00ug/mL，將該標(biāo)準(zhǔn)系列分別進(jìn)樣20燦L，以DON的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　1.5驗(yàn)證

　　(1)空白樣品制備取空白樣品，依據(jù)樣品的處理方法進(jìn)行處理。

　　(2)回收率及精密度試驗(yàn)取空白樣品。加入不同體積DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使其最終進(jìn)樣液理論質(zhì)量比分別為100、300、1 000 Ixg/kg。每個(gè)質(zhì)量比取5個(gè)平行樣，根據(jù)樣品的處理方法進(jìn)行處理。

　　2 結(jié)果

　　2.1定性分析

　　DON標(biāo)準(zhǔn)樣品定性分析色譜圖見(jiàn)圖1。

　　由圖l可以看出DON保留時(shí)間為14.095 min。

　　2.2定量計(jì)算

　　樣品中DON含量為

　　式中：x——樣品中DON的含量，ug/kg;C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得進(jìn)樣液質(zhì)量濃度，ug/mL;樣品質(zhì)量，g

　　2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　由圖2可見(jiàn)線性關(guān)系為Y=20.78521X(R=0.99987)，根據(jù)信噪比3倍峰面積，計(jì)算出本方法的

　　最低檢出限為50ug/kg。

　　2.4 方法驗(yàn)證

　　2.4.1專屬性

　　從圖3可見(jiàn)。在DON的出峰時(shí)間14.095 min左右沒(méi)有雜質(zhì)干擾峰，表明本方法專屬性很好。

　　2.4.2 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

　　取兩組不同含量的樣品各6個(gè).分別確定方法的精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

　　取同一樣品，分別加入不同質(zhì)量比的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定回收率.結(jié)果見(jiàn)表2。

　　從表2可見(jiàn).該檢測(cè)方法回收率為90.7%-98.9%，可以滿足分析的需要。

　　3討論

　　3.1提取方法對(duì)回收率的影響目前，采用較多的提取液是y(乙腈)：y(水)=84：16，但提取方法卻各不相同，本方法則采用高速均質(zhì)4 rain。用4種常見(jiàn)的提取方法對(duì)添加同樣質(zhì)量濃度0.50 la,g/mL的樣品進(jìn)行提取，測(cè)定其回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

　　由表3可以看出，振蕩、超聲、磁力攪拌提取方法的平均回收率只有70%左右，不能滿足分析的需要，而高速均質(zhì)法可使平均回收率達(dá)到95.9%。作者曾進(jìn)一步改變高速均質(zhì)的時(shí)間來(lái)對(duì)比回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著均質(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)回收率有小幅上升，當(dāng)均質(zhì)時(shí)間大于4 min后�；厥章薀o(wú)明顯提高。故本方法確定的最佳提取方式是高速均質(zhì)4 min。

　　3.2液相色譜法與氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法測(cè)定谷物中DON的效率及不確定性比較GB/T5009.111-20031第二法中規(guī)定采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，而現(xiàn)在氣相色譜檢測(cè)方法也倍受關(guān)注。將這3種方法在檢測(cè)效率及不確定性方面做了比較2，見(jiàn)表4。

　　3種方法比較表明：氣相色譜法需要的檢測(cè)時(shí)間最長(zhǎng)，液相色譜法需要的檢測(cè)時(shí)間最短;從對(duì)檢測(cè)環(huán)境的要求來(lái)比較。液相色譜法和氣相色譜法都對(duì)環(huán)境溫度不做要求。而酶聯(lián)免疫法的穩(wěn)定性受環(huán)境溫度影響較大;從操作時(shí)間的要求來(lái)比較，液相色譜法和氣相色譜法因?yàn)樵诿總�(gè)操作步驟中沒(méi)有較多的時(shí)間上的要求，所以不會(huì)因?yàn)樘幚順悠窋?shù)量多而造成前后樣品反應(yīng)時(shí)間不同而形成的誤差，而酶聯(lián)免疫法由于每步受到嚴(yán)格的時(shí)間限制，所以每批不可處理太多樣品。以免產(chǎn)生誤差。從而使檢測(cè)變得繁瑣。

　　比較3種方法的效率不確定性后可以看出.本方法測(cè)定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇比氣相色譜法和酶聯(lián)免疫法具有優(yōu)勢(shì)。

　　4 結(jié)論

　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了一種測(cè)定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的液相色譜方法.回收率高、精密度和準(zhǔn)確性好。較氣相色譜法和酶聯(lián)免疫法具有很高的檢測(cè)效率，而且對(duì)環(huán)境的要求比較低，操作簡(jiǎn)單易行。