反相HPLC多肽分離中流動相和溫度的作用
反相HPLC多肽分離中流動相和溫度的作用
把多肽從RP-HPLC柱子上脫附和洗脫下來用的是含有機調(diào)節(jié)劑和離子對溶劑或緩沖液的水溶劑。有機調(diào)節(jié)劑把多肽從疏水性表面溶解并脫附下來，同時離子對試劑或緩沖液調(diào)節(jié)洗脫pH值，并與多肽相互作用以加強分離。洗脫采用的是逐漸提高色譜時有機溶劑濃度(溶劑梯度)的方法。當(dāng)溶劑達到能引起脫附的濃度時，多肽就從色譜柱子上脫附并洗脫下來。
有機調(diào)節(jié)劑
有機試劑的作用是把多肽分子從疏水性的吸附表層脫附下來，慢慢升高有機溶劑的濃度(梯度)，直到多肽脫附并洗脫下來。
乙腈(ACN)
乙腈(ACN)是最常用的有機調(diào)節(jié)劑，這是因為它：
■ 易揮發(fā)，容易從收集的組分中除去;
■ 粘度低，柱壓小;
■ 短波幾乎無紫外(UV)吸收;
■ 經(jīng)長期使用證明，其在RP-HPLC多肽分離中可靠。
異丙醇
異丙醇常用于大分子蛋白質(zhì)或非常疏水的蛋白質(zhì)。異丙醇的主要缺點是粘度大。為了降低異丙醇的粘度而保持其疏水性，我們建議使用乙腈：異丙醇為50:50的混合液。在有些情況下，在乙腈中加1-3%的異丙醇能增加蛋白質(zhì)的回收率。
乙醇
乙醇常用于過程規(guī)模純化。乙醇是一種優(yōu)良的RP-HPLC的溶劑，它價格低，與FDA等管理機構(gòu)所熟悉。乙醇已用于洗脫疏水性的跨膜蛋白質(zhì)，也用于純化處理。
甲醇或其它溶劑
甲醇或其它溶劑與常用的溶劑相比沒有什么優(yōu)點，而且不用與多肽分離。
洗脫梯度
洗脫多肽幾乎總使用梯度溶劑。慢慢增加有機溶劑的濃度，能得到最尖銳的峰和最好的分離度。
多肽分離通常首選梯度洗脫。等度洗脫往往產(chǎn)生寬峰，所以等度洗脫時最好選用非常小的梯度。典型的溶劑梯度是每分鐘有機調(diào)節(jié)劑濃度增加的斜率為0.5-1%。像每分鐘0.0 5-0.1%這樣極低的梯度能獲得最大的分離度。圖1(見第2頁)中胰島素變異物的分離所用的梯度斜率每分鐘只有0.25%。圖17表明，對蛋白質(zhì)來說，減少梯度的斜率通常能提高分離度。
采用低梯度時酶亞基分離度提高
圖17.色譜柱：C18 (VYDAC 218TP104) 流速：1 mL/min 洗脫液：如圖所示梯度，梯度從25%到50%ACN的TFA水溶液。 樣品：細胞色素C氧化酶亞基。 數(shù)據(jù)來自參考文獻21。
為了達到最佳重現(xiàn)性和平衡，要避免使用極限濃度的有機調(diào)節(jié)劑。我們建議，有機調(diào)節(jié)劑的起始濃度不要低于3-5%。起始濃度低的有機調(diào)節(jié)劑梯度會因為柱子表面很難“潤濕”，而引起色譜柱平衡時間過長或沒有重現(xiàn)性。我們建議有機調(diào)節(jié)劑的結(jié)束梯度不要超過95%。有機濃度過高會洗去全部有機相上的水，也會使柱平衡更加困難。
梯度斜率對肽選擇性的影響
由于有些肽和反相柱子表面發(fā)生作用的方式有微小的差異，所以溶劑梯度的斜率可能會影響肽的選擇性，由此影響肽之間的分離度。
通過在不同的梯度時間，用不同的梯度斜率分離人生長激素的胰蛋白酶消化物，可以很好闡明這種影響。圖18中是在三種不同的梯度斜率(時間)，對人生長激素的胰蛋白酶消化物一些碎片的分離。隨著斜率的降低，碎片9和10的表現(xiàn)和預(yù)期的一樣，即分離度隨著梯度斜率的降低(梯度時間增加)而提高。但是，碎片11和12表現(xiàn)不同。分離度隨著梯度斜率的降低而減小，這表明改變梯度斜率時選擇性發(fā)生了變化。如果要改進方法并考查該方法對每一肽對的影響，當(dāng)溫和地改變梯度斜率時，要對這種影響進行監(jiān)控。
離子對試劑和緩沖液
離子對試劑或緩沖液調(diào)節(jié)洗脫pH值，并與多肽作用，從而加強分離。
三氟乙酸
應(yīng)用最廣的離子對試劑是三氟乙酸(TFA)，其應(yīng)用廣泛的原因是：
■ 易揮發(fā)，易于從收集組分中分離;
■ 短波段幾乎無紫外(UV)吸收;
■ 經(jīng)長期使用證明，其在RP-HPLC多肽分離中可靠。
TFA通常使用的濃度為0.1%(w/v)左右。0.5%的TFA濃度用來溶解更大分子的或更疏水的蛋白質(zhì);低濃度的TFA則偶爾用于胰蛋白酶消化物的分離。雖然新發(fā)展的色譜柱允許使用更低濃度的TFA，但當(dāng)TFA濃度低于0.1%時，蛋白質(zhì)的色譜圖峰形會退化(見28頁)。
若用TFA濃度不變的洗脫梯度，當(dāng)在210-220nm檢測時，有時會出現(xiàn)基線漂移。
水溶劑到非水溶劑的介電常數(shù)的變化會影響π–π電子相互作用，反過來影響190-250nm范圍的吸收光譜，導(dǎo)致在很多反相分離中出現(xiàn)基線漂移。為了減少或消除由TFA光譜吸收造成的基線漂移，盡可能把波長調(diào)整到215nm，并在B液中比A液少加15%的TFA以補償基線漂移。比如，A液中用0.1%的TFA，B液中用0.085%的TFA。
使用質(zhì)量好的和小量的TFA很重要。劣質(zhì)的或過期的TFA可能會含有雜質(zhì)，這些雜質(zhì)在色譜圖中會出現(xiàn)假峰(見附錄B)。
TFA濃度對選擇性的影響
三氟乙酸的濃度會影響特定肽對的選擇性或分離度。
雖然流動相中TFA的濃度通常在0.05-0.1%之間，但改變TFA的濃度也會對肽的選擇性產(chǎn)生微小的影響，見圖19。這就意味著，要得到好的重現(xiàn)性，在肽分離方法中，謹慎控制TFA的濃度很重要。這也提供了優(yōu)化肽分離度的另一種方法。選擇了色譜柱和梯度條件后，通過輕微改變TFA的濃度，能進一步優(yōu)化肽對之間的分離度。
圖19.TFA濃度不同造成肽分離模式產(chǎn)生明顯的差異。 色譜柱：C18 (VYDAC 218TP54) 流速：1 mL/min 洗脫液：TFA水溶液中梯度變化0-50% CAN，濃度如圖所示。 樣品：脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的胰蛋白酶消化物。 注：圖中顯示的是色譜圖的一部分。
雖然TFA廣泛用于離子對試劑，但使用其它試劑也能得到比TFA更高的分離度。在對五種小肽的分離中(圖20)，有些肽用磷酸鹽得到了比用TFA更尖的峰，使催產(chǎn)素與緩激肽的洗脫順序顛倒了過來。最后三個峰用磷酸鹽比用TFA要更尖，這是因為磷酸鹽與堿性側(cè)鏈發(fā)生了反應(yīng)，增加了肽的硬度。緩激肽在用磷酸鹽時比用TFA洗脫得早，因為TFA與緩激肽中的兩個精氨酸發(fā)生配對，導(dǎo)致保留時間相對延長。另外，在TFA分離時隱藏著的兩個小雜質(zhì)，在用磷酸鹽分離時顯現(xiàn)出來了(圖20B)。鹽酸也顛倒了催產(chǎn)素與緩激肽的洗脫順序，并分離出用TFA時看不見的雜質(zhì)(圖20C)。
肽分離時TFA及替代性離子配對試劑/緩沖液的比較
圖20.使用TFA(A)、磷酸鹽(B)、HCl(C)作為緩沖液/離子配對試劑洗脫五種肽。 色譜柱：VYDAC 218TP54 (C18,5μm, 4.6x250mm). 洗脫液：15-30% CAN，1.0 mL/min，30 min加 A. 0.1%TFA B.20mM磷酸鹽,pH2.0 C.5mM HCl,pH 2.0 肽：1.催產(chǎn)素 2.緩激肽 3.血管緊張素II 4.神經(jīng)緊張素 5. 血管緊張素I。
七氟丁酸(HFBA)能有效地分離堿性蛋白質(zhì)，三乙胺磷酸鹽(TEAP)已用于制備分離。有研究表明，用TEAP比用TFA的樣品容量大。10-60%濃度的甲酸已用于非常疏水性多肽的色譜分析。甲酸也用于肽的LC/MS分離，因為TFA降低了電噴霧接口的離子信號;揮發(fā)酸、甲酸已被證明在肽的LC/MS中很有效(見26-29頁關(guān)于LC/MS的詳細討論)。Guo及其同事比較了TFA,HFBA和磷酸在肽洗脫中的使用，發(fā)現(xiàn)它們都有不同程度的選擇性。
pH對肽分離的影響
由于酸性或堿性側(cè)鏈的質(zhì)子化或去質(zhì)子化作用，肽分離對洗脫pH通常比較敏感，如圖21所示。pH4.4時(圖21B)五種肽都比在pH2.0時(圖21A)洗脫得早，肽的保留時間也相對發(fā)生變化。這是肽中酸性基團的電離造成的。緩激肽和催產(chǎn)素在pH2.0時分離得很好，但在pH4.4時同時洗脫。pH6.5時(圖21C)肽的保留時間比在pH4.4時要長，但洗脫順序有很大不同，血管緊張素II,在pH2.0-4.4時第三洗脫，現(xiàn)在第一洗脫出來了。神經(jīng)緊張素比催產(chǎn)素早洗脫，緩激肽與神經(jīng)緊張素同時洗脫。這說明，pH對肽選擇性產(chǎn)生很大影響，能作為優(yōu)化肽分離的工具。
合成聚合物反相材料將實際pH的范圍擴大到將近pH14(見13頁的圖13)。如圖22所示，肽在高pH值時與低pH值時的洗脫有很大不同。在pH值從2變到9時，樣品中肽的洗脫順序發(fā)生了明顯的改變。
圖21.用磷酸鹽作緩沖液，pH在2.0、4.4、6.5時五種肽的洗脫。 色譜柱：VYDAC 218TP54 (C18,5μm,4.6x250mm). 洗脫液：15–30% CAN，1.0mL/min，30min;加A. 20 mM磷酸鹽,pH 2.0 B.20mM磷酸鹽，pH 4.4 C.20mM磷酸鹽,pH 6.5 肽：1. 緩激肽 2.催產(chǎn)素 3. 血管緊張素II 4.神經(jīng)緊張素 5.血管緊張素I.
用HPLC從蛋白質(zhì)消化物中分離肽碎片的操作條件
雖然大部分酶標記操作使用0.1%TEA作為李子配對試劑，但用別的離子配對試劑或高pH有時能得到更好的分離度。
TFA廣泛用作離子配對試劑，也是肽分離的最好起始點。但是也要考慮使用磷酸鹽或鹽酸等緩沖液，或研究pH的影響，以優(yōu)化肽的分離。為了測試pH的影響，配制100mM磷酸鹽溶液(pH約4.4)。取三分之一用磷酸調(diào)整到pH2.0，三分之一用NaOH調(diào)整到pH6.5。然后稀釋每份溶液至10-20mM用作洗脫緩沖液。用TFA測肽的分離度，這三份磷酸鹽緩沖液(pH2.0，pH4.4，pH6.5)和鹽酸都是為了實現(xiàn)良好的肽分離而尋找最優(yōu)試劑和pH條件的很好的方法。
合成聚合物(聚苯乙烯-二乙烯苯基)色譜柱在低和高pH時對肽的分離
圖22.色譜柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB,5μm,4.6x150mm) 洗脫液：15–30% CAN，15 min，加A.0.1% TFA pH 2. B. 15 mM NaOH, pH 9. 流速：1.0 mL/min 肽：1.催產(chǎn)素 2.緩激肽 3.神經(jīng)緊張素 4.神經(jīng)緊張素1-8 5.血管緊張素III. 6. val-4 血管緊張素III
流動相流速
流速對多肽分離沒有什么影響。流速不影響多肽從反相表面脫附和之后的保留時間。
只有有機調(diào)節(jié)劑濃度達到一定濃度時，多肽才發(fā)生脫附。所以蛋白質(zhì)的分離，相對地不受流動相流速的影響。
洗脫流速會影響小肽的分離度，這是因為小肽在RP-HPLC色譜柱上的行為介于蛋白質(zhì)和小分子之間(見第4頁)。Stone和Williams發(fā)現(xiàn)，從羧甲基轉(zhuǎn)鐵蛋白的胰蛋白酶消化物中分離出的肽碎片的數(shù)量取決于洗脫流速。在分析型HPLC色譜柱上，流速0.2mL/min時，只分離出不到80個肽碎片，而流速為0.8 mL/min時能分離出116個肽碎片。流速在0.5-1.0mL/min之間，分離出的肽碎片數(shù)量沒有什么變化。
要注意的是，精煉小肽分離時分離度是有限的，可以通過較小的洗脫流速的變化來獲得分離度微小的提高。流速也會影響分離的其它方面，比如：
檢測靈敏度
低流速只能洗脫小量的多肽，吸附與敏感度也因此增加。HPLC窄徑色譜柱能提高檢測靈明度，這主要是因為它能在低流速下運行，洗脫多肽所用溶劑的量也很小。
樣品溶解性
高流速能提高熟水性多肽的溶解性，雖然這樣也會增加純化該樣品的溶劑用量。
柱壓
柱壓與流速有直接的關(guān)系。流速越大，柱壓越高。
梯度
流速的變化會影響梯度斜率與峰形，這取決于硬件的配置。由于多肽分離對梯度條件敏感，調(diào)整流速會改變其對梯度斜率的影響而改變分離度。
溫度對肽分離的影響
柱溫會影響溶劑粘度，柱壓和保留時間，也會影響肽的選擇性。
肽做色譜時溫度是一個重要的分離參數(shù)。在每個HPLC方法中，應(yīng)該優(yōu)化溫度分離多肽。如圖23所示的是從人生長激素的胰蛋白酶消化物中分離碎片。20oC時，碎片11、12、13幾乎同時洗脫。隨著溫度的升高，碎片13的保留值比碎片11、12要長，所以40oC時這三者的分離度很好。但60oC時，碎片11和12同時洗脫，說明了隨溫度升高，選擇性的變化。在20oC時，碎片15比碎片10洗脫得早，40oC時它們幾乎同時洗脫，60oC時碎片10首先洗脫，兩者得到很好的分離。這些結(jié)果說明了溫度對肽選擇性的重要影響。
溫度對肽分離的影響
圖23.色譜柱：C18, 4.6 x 150 mm 流速：1 mL/min. 洗脫液：梯度漸變 0–60% CAN+1% TFA水溶液，60 min。 溫度：如圖所示 樣品：人生長激素的胰蛋白酶消化物。 數(shù)據(jù)來自參考文獻39。
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