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多肽反相HPLC分離中色譜柱的作用

HPLC色譜柱為多肽吸附提供疏水性的表面。色譜柱由不銹鋼管構(gòu)成,內(nèi)部填充微徑、球形的吸附微粒，微粒通常采用硅膠，硅膠微粒的表面已經(jīng)用硅烷試劑反應(yīng)過以使其疏水。合成聚合物(比如聚苯乙烯- 二乙烯基苯)也可以用作多肽的HPLC吸附劑。

吸附劑的孔徑

HPLC吸附劑是多孔微粒，用于反應(yīng)的表面大部分位于小孔中。因此，多肽分子必須進(jìn)入孔中才能被吸附和分離。

HPLC曾多年使用孔徑約100Å的微粒。這種多肽色譜法很差，部分是因?yàn)樵S多多肽分子太大而無法進(jìn)入這種直徑的孔中。Grace Vydac為HPLC改進(jìn)的大孔徑(～300 Å)球形硅膠微粒宣告了用RP-HPLC有效分離多肽的開始。今天，雖然有些肽(<～2000 MW)也能用100 Å孔徑的微粒分離，但大多數(shù)多肽都是用孔徑約300 Å的微粒填充色譜柱來完成分離的。

吸附劑粒度

色譜柱中吸附劑的粒度影響洗脫峰寬，小直徑的微粒通常產(chǎn)生更尖的峰和更高的分離度。

毛細(xì)分析和少量制備分離推薦使用5微米材料(色譜柱內(nèi)徑10mm)。直徑大一點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室色譜柱通常裝填10µm的材料。內(nèi)徑大于22mm的過程色譜柱通常裝填15 µm或更大的微粒，其粒度分配也比用于分析型色譜柱的寬(見40-42頁)。

吸附相種類

通過氯硅烷把疏水相鍵合到硅膠基質(zhì)上就形成了反相HPLC吸附劑，這些硅膠基質(zhì)分子上有一個(gè)能附著疏水基團(tuán)的活性氯基。

形成疏水相的烴基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的線性脂肪族烴。烴鏈的長(zhǎng)度在蛋白質(zhì)分離效果上一般沒有什么不同。分離給定大小和疏水性的多肽時(shí)哪種固定相可能最有效有規(guī)可循，參見圖7中的總結(jié)。對(duì)于肽和少于5000道爾頓的小分子蛋白質(zhì)最好選用C18色譜柱。最小的分子和最親水的肽通常在小孔的C18柱子上分離得最好。大于5000道爾頓的蛋白質(zhì)或小分子多肽非常疏水，最好選用C4色譜柱。C8柱與C18色譜柱的應(yīng)用差不多，但分離個(gè)別肽時(shí)有時(shí)表現(xiàn)出不同的選擇性和分離能力。苯基柱沒有C4柱子那么疏水，所以對(duì)有些多肽表現(xiàn)出獨(dú)特的選擇性。

反相表面的細(xì)微差別有時(shí)會(huì)造成RP-HPLC對(duì)多肽選擇性的不同，可以利用這一點(diǎn)來優(yōu)化特定肽的分離。

如圖8所示，肽分離的選擇性可能受疏水表面性質(zhì)的影響。圖中所示的五種肽的選擇性在C18和C4色譜柱上幾乎一樣，雖然在C4柱子中的保留時(shí)間短。苯基柱與C18柱相比，保留時(shí)間短，選擇性也不同。緩激肽含有兩個(gè)苯丙氨酸，與其它肽相比，其在苯基柱上的保留時(shí)間比在C18柱上稍長(zhǎng)。

圖8. 肽在不同反相色譜柱上的分離。色譜柱：VYDAC 218TP54 (C18); 214TP54 (C4); 219TP54(苯基) 洗脫液：15-30%ACN+0.1%TFA，1.0mL/min，30min 樣品：1.催產(chǎn)素， 2.緩激肽， 3.血管緊張素II， 4.神經(jīng)緊張素， 5. 血管緊張素I

血管緊張素I含有一個(gè)組胺酸，血管緊張素II含有兩個(gè)組胺酸。在苯基柱子上，這兩者都比其它肽洗脫得早。分離肽時(shí)(比如蛋白質(zhì)消化物中的肽)，最好試用不同的疏水相，以選出針對(duì)特定肽混合物具有最佳選擇性的相來。肽的RP-HPLC分離基于肽和反相表面之間的微妙作用。反相表面的微小變化能影響肽的分離，雖然小但很重要。有些肽的分離對(duì)鍵合在硅膠基質(zhì)上的疏水相的密度和均勻度非常敏感(圖9)。

圖9.低碳裝填C18RP-HPLC色譜柱(B)分離在標(biāo)準(zhǔn)碳裝填色譜柱(A)上只有部分分離的兩種肽。色譜柱：A. VYDAC 218TP52-標(biāo)準(zhǔn)C18,5μm,2.1x250mm B. VYDAC 218LTP52低碳負(fù)載C18，5μm,2.1x250mm 洗脫液：6 mM TFA/4mM HFBA，11-95%ACN,0.25mL/min,75min 樣品：Asp-N蛋白質(zhì)消解物。

不同的反相吸附劑在分離蛋白質(zhì)酶消化物中的肽碎片時(shí)可能表現(xiàn)出不同的選擇性。用兩種RP-HPLC色譜柱分離β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，結(jié)果表明：不同的相有時(shí)對(duì)肽的反相分離具有微小的影響(圖10)。與通常使用的C18色譜柱相比，C4柱的保留時(shí)間稍短，肽碎片洗脫圖形也有某些程度上的不同。測(cè)試不同的色譜柱是確定哪個(gè)柱子分離度最好的唯一實(shí)用的方法。有些實(shí)驗(yàn)室利用反相色譜柱的選擇性差異來進(jìn)行肽的二維分離。

圖10. 色譜柱：VYDAC 218TP54 (C18);214TP54 (C4);洗脫液：0-30%ACN+0.1%TFA水溶液，1.0 mL/min，60min。樣品：β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化液。

什么是聚合物鍵合?它又是怎樣影響肽的選擇性的?反相HPLC吸附劑一般通過把含有一個(gè)活性氯的氯硅烷烴鍵合到硅膠基質(zhì)上制成。這些就形成了所謂的單體鍵合相，它在硅膠基質(zhì)上有一個(gè)附著點(diǎn)。也可以用具有多個(gè)活性氯的氯硅烷烴，這就是所謂的聚合物鍵合相，單個(gè)氯硅烷烴在相中交聯(lián)并在硅膠基質(zhì)上面形成硅氧烷聚合物，同時(shí)附著多個(gè)疏水鏈。雖然單體鍵合相與聚合物鍵合相的疏水性和分離特性相似，但在分離肽時(shí)，尤其是蛋白質(zhì)的酶消化物中的肽時(shí)，它們會(huì)具有不同的選擇性。這種不同的選擇性為色譜工作人員優(yōu)化蛋白質(zhì)消化物和其它肽的選擇性和分離度提供了更多的選擇空間。圖11給出了用單體鍵合吸附劑和聚合物鍵合吸附劑分離一系列合成多肽的例子。這些肽分離選擇性的明顯差異已經(jīng)標(biāo)出，但同時(shí)也提供了進(jìn)行肽分離時(shí)對(duì)色譜柱的另一種選擇。

圖11.色譜柱：聚合物鍵合色譜柱VYDAC 218TP54與238TP54單體鍵合色譜柱(C18,5μm,4.6x250mm) 洗脫液：10-40%ACN+0.1%TFA，30min。流速：1.0 mL/min。

合成聚合物吸附劑的作用

雖然硅膠HPLC色譜柱在酸性pH和周圍溫度的溫和條件下表現(xiàn)良好，但在極端條件(高pH、高溫)下，硅膠色譜柱的效果就會(huì)降低。合成聚合物(比如比如聚苯乙烯- 二乙烯基苯)能為多肽分離提供機(jī)械強(qiáng)度高的基質(zhì)。

硅膠色譜柱在中度pH與溫度的操作環(huán)境下表現(xiàn)良好，但有時(shí)也會(huì)需要在比常規(guī)pH、溫度高或在高濃度的離液劑(比如鹽酸胍)中操作的需要。聚苯乙烯- 二乙烯基苯等機(jī)械強(qiáng)度高的合成聚合基質(zhì)在苛刻的條件下比較穩(wěn)定，可以作為實(shí)用的硅膠替代品。圖12表示的是用合成聚苯乙烯- 二乙烯基苯色譜柱對(duì)幾種多肽的分離。其性能和硅膠色譜柱相似，這樣就使在相對(duì)苛刻的條件下用合成聚合基質(zhì)進(jìn)行多肽分離成為可能。

圖12.合成聚合物色譜柱(聚苯乙烯-二乙烯基苯)對(duì)肽的分離。色譜柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB, 5μm,4.6x150mm) 洗脫液：15–30% ACN+0.1% TFA，15min。流速：1.0mL/min 肽：1.催產(chǎn)素 2.緩激肽 3.神經(jīng)緊張素 4. 神經(jīng)緊張素1–8 5.血管緊張素III 6. val-4血管緊張素III

用合成聚合物制成的分離材料的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它們?cè)趐H極值時(shí)不分解。這樣，在色譜后能使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液作為清洗劑把蛋白質(zhì)或其它物質(zhì)從色譜柱上洗下來，見圖13，在這個(gè)例子中，基于聚苯乙烯- 二乙烯基苯的色譜柱可以用強(qiáng)堿(1N氫氧化鈉)和強(qiáng)酸(1N硫酸)進(jìn)行清洗。清洗前、用強(qiáng)酸清洗后和用強(qiáng)堿清洗后肽的色譜分析都產(chǎn)生相似的峰形、保留時(shí)間和分離度，這證明用強(qiáng)試劑清洗柱子并不會(huì)對(duì)色譜柱的性能產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖13.用強(qiáng)試劑清洗前(A)、用1N NaOH清洗后(B)、用1N硫酸清洗后(C)，合成聚合物(聚苯乙烯-二乙烯基苯)色譜柱對(duì)肽的分離情況。色譜柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB, 5μm,4.6x150mm) 洗脫液：15–30%ACN+ 0.1%TFA，15min 流速：1.0 mL/min 肽：1.催產(chǎn)素 2.緩激肽 3. 血管緊張素III 4. 章魚素 5.神經(jīng)緊張素

色譜柱尺寸：柱長(zhǎng)

影響蛋白質(zhì)分離的吸附/脫附幾乎全部發(fā)生在色譜柱的頂端。因此，柱長(zhǎng)并不顯著影響蛋白質(zhì)的分離和分離度。于是，常用5-15cm的短柱分離蛋白質(zhì)。蛋白酶消化物中的小分子肽用長(zhǎng)柱子分離較好，15-25cm長(zhǎng)的色譜柱常用于合成肽、天然肽與酶消化標(biāo)記物的分離。例如，Stone和Williams發(fā)現(xiàn)：與用150mm柱(80個(gè)峰)和50mm柱(65個(gè)峰)相比，用250mm柱子(104個(gè)峰)能從羧甲基轉(zhuǎn)鐵蛋白的胰蛋白酶消化物中分離出更多的肽碎片。

柱長(zhǎng)對(duì)分離的其他方面也有影響。

樣品容量

樣品容量是色譜柱體積的函數(shù)。對(duì)等直徑的柱子而言，柱子越長(zhǎng)樣品容量越大。

柱壓

柱壓與柱長(zhǎng)成正比。當(dāng)用異丙醇等粘性更大的溶劑時(shí)，較短的柱子會(huì)產(chǎn)生較低的柱壓。

柱子尺寸：直徑

柱子直徑不影響峰分離，但影響進(jìn)樣、溶劑使用和檢測(cè)靈敏度。隨著HPLC柱子直徑的減小，流速相應(yīng)降低，由此，溶劑的使用量減少，檢測(cè)靈敏度提高。液質(zhì)(LC/MS)聯(lián)用時(shí)，直徑非常小的HPLC柱子尤其有用。

分析1-200微克多肽樣品的分析柱標(biāo)準(zhǔn)直徑是4.6mm。較大直徑的色譜柱用于大量多肽的純化(見40-48頁制備分離)。近年來，小直徑柱子(0.075mm到2.1mm)的使用有所增加，因?yàn)樾≈睆街佑幸韵聝?yōu)點(diǎn)：

減少溶劑用量

用于毛細(xì)色譜柱和小孔色譜柱的流速為每分鐘幾微升(見50頁附錄A)。低流速能顯著減少多肽分離所需的溶劑量。

增加檢測(cè)靈敏度

低流速的小孔色譜柱洗脫多肽所需的溶劑體積較少。檢測(cè)器反應(yīng)隨著流速的降低而增強(qiáng)。流速200mL/min的窄徑柱的靈敏度是流速1.0mL/min分析型色譜柱的六倍。

能處理小量樣品

檢測(cè)靈敏度增加意味著能檢測(cè)小量樣品。用窄徑RP-HPLC柱能分離和收集5納摩爾的胰蛋白酶消化產(chǎn)物。

與質(zhì)譜接口

小孔色譜柱可以直接將HPLC洗脫液轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜接口中，用精密的MS儀器可對(duì)阿摩爾(10-18)級(jí)的單個(gè)樣品進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。(見28-31頁LC/MS)。

小直徑色譜柱的當(dāng)今趨勢(shì)

窄徑柱

內(nèi)徑2.1mm的微孔柱流速為100-300mL/min。對(duì)于大多數(shù)想減少溶劑用量、提高檢測(cè)靈敏度的實(shí)驗(yàn)室來說，微孔柱是一個(gè)實(shí)用的措施。大部分標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)都能在這些低流速下運(yùn)行，而很少需要或不需要修改。200mL/min左右的微孔柱與空氣輔助質(zhì)譜有很好的接口。

微孔柱和毛細(xì)柱

雖然使用直徑1.0mm或更小的色譜柱，溶劑用量明顯減少、檢測(cè)靈敏度也有所提高，但是，它們的HPLC系統(tǒng)需要修改，或用于該目的的特制儀器。

進(jìn)行數(shù)據(jù)流分割后，毛細(xì)色譜柱能與電噴霧甚至納升電噴霧質(zhì)譜儀接口。

Davis和Lee的在一篇論文中提供了用微孔柱和毛細(xì)管柱取得最佳性能的有價(jià)值的信息，值得使用小孔色譜柱的人閱讀。很多期刊都有關(guān)于質(zhì)譜與毛細(xì)管柱聯(lián)用的詳細(xì)論文(見26-29頁)。

例子

微孔柱。圖14表示的是用微孔柱(內(nèi)徑1.0mm)對(duì)血紅素的胰蛋白酶消化物的分離。

圖14. 用微孔R(shí)P-HPLC色譜柱對(duì)血紅素的胰蛋白酶消化物的分離(參考文獻(xiàn)26)。色譜柱：C18, 1.0x250mm(VYDAC 218TP51)。流速：50 μL/min 洗脫液：0-40%梯度的B，50min，溶劑A為0.1% TFA水溶液，溶劑B為0.1% TFA乙腈溶液。

毛細(xì)管柱。圖15所示的是用內(nèi)徑75µm的毛細(xì)管柱對(duì)肌球素的胰蛋白酶消化物分離的例子。

圖15. 毛細(xì)RP-HPLC色譜柱對(duì)肌球素的胰蛋白酶消化物的分離。色譜柱：C18 (VYDAC 218MS), 內(nèi)徑75μm，毛細(xì)管柱流速：0.5 μL/min 洗脫液：水/TFA/乙腈的梯度洗脫。

毛細(xì)管柱進(jìn)樣量。圖16表示的是用內(nèi)徑300µm的毛細(xì)管柱對(duì)3皮摩爾BSA的胰蛋白酶消化物的分離，采用質(zhì)譜檢測(cè)。

圖16.用內(nèi)徑300µm的毛細(xì)RP-HPLC色譜柱對(duì)BSA的胰蛋白酶消化物的分離。樣品：3皮摩爾色譜柱：VYDAC 218MS5.305 5μm, 300 A, 聚合物-C18反相柱(300μm 內(nèi)徑x 50mm柱長(zhǎng)). 流速：5 μL/min. 流動(dòng)相: A = 0.1%甲酸，98%水,2% CAN;B = 0.1% 甲酸, 98% ACN, 2%水。梯度：3%B保持0-5分鐘，然后從3%B漸變到65min時(shí)的50%B，最終70min時(shí)漸變到75%B。檢測(cè)器：質(zhì)譜(MS)。 (a)總離子數(shù)。(b)基峰強(qiáng)度。基峰是指色譜圖中每次振幅最大時(shí)的單個(gè)質(zhì)譜峰。基峰的色譜圖強(qiáng)調(diào)了含有單個(gè)主要分子的峰，消除了異常峰和噪聲。

多肽反相HPLC分離中色譜柱的作用

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