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高效液相色譜法測(cè)定化學(xué)合成生物多肽

高效液相色譜法測(cè)定化學(xué)合成生物多肽

多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對(duì)具有一定生物活性的多肽的研究，一直是藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)主要方向。80年代中期至今多肽化學(xué)合成技術(shù)有很大發(fā)展，合成的成品一般是以目標(biāo)多肽為主的幾種結(jié)構(gòu)相似多肽的混合物，對(duì)多肽混合物的分離分析及純度鑒定一直是一個(gè)重要問(wèn)題。本文主要介紹本人在分析多肽類化合物過(guò)程中的一些心得和經(jīng)驗(yàn).

首先，在色譜柱選擇方面，因?yàn)槎嚯牡姆肿恿枯^大(一般在幾千到幾萬(wàn))，分子量在10000左右的，常用的C18柱分離效果不太好，要選用碳鏈比較短的色譜柱，如：C8或者C4;填料孔徑不能選普通的100埃，要選孔徑比較大的如300埃等。分子量在幾萬(wàn)或者幾十萬(wàn)的，可以選體積排阻色譜，用凝膠色譜柱。

其次，在用反相色譜柱時(shí)，因?yàn)槎嚯氖怯砂被�酸組成的，流動(dòng)相選擇一般用含0.1%的三氟乙酸水和含0.1%的三氟乙酸乙腈的梯度洗脫。但因?yàn)槎嚯念惢�合物的紫外吸收較弱，檢測(cè)波長(zhǎng)一般選在200~210nm左右，所以空白梯度的基線會(huì)往上漂移很多，特別是樣品濃度比較小的時(shí)候，分析誤差較大�？紤]乙腈的本底吸收比水大，在梯度洗脫過(guò)程中，隨著乙腈比例的增大，基線會(huì)向上漂。因此把乙腈中的三氟乙酸濃度降為0.05%~0.07%(可以隨梯度不同選不同濃度)，通過(guò)兩者紫外吸收的抵消，基線變得平穩(wěn)很多，同時(shí)能增加檢測(cè)的靈敏度，使分析更靈敏、更準(zhǔn)確。

第三，合成的多肽中的雜質(zhì)一般與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，極性相差無(wú)幾，分離難度較大，在選擇洗脫梯度時(shí)要細(xì)心一點(diǎn)，多做一些試驗(yàn)，最好要做主峰的純度掃描，盡量把雜質(zhì)完全分開(kāi)，對(duì)于難分離的多肽，可以選長(zhǎng)一點(diǎn)的色譜柱或者延長(zhǎng)梯度洗脫的時(shí)間。

還有最后一招，如果按以上方法分離還是不太好的話，可以適當(dāng)?shù)奶岣咧鶞�，我們有一品種就是這樣的，當(dāng)柱溫升到60度時(shí)，塔板數(shù)和與雜質(zhì)的分離度都能得到一定的改善。

HPLC 分析柱有兩類：離子交換柱和反相柱。離子交換 HPLC 依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用，柱子在一定 PH 范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷，分離是一種電荷相互作用，通過(guò)改變 PH 值、 離子強(qiáng)度，達(dá)到分離純化的效果。通常，先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng)，直到多肽從柱中洗脫出。

反相 HPLC 條件與正常層析正相反，多肽通過(guò)疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成，這種鏈長(zhǎng)度為 G4-G8 碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。長(zhǎng)鏈柱比短鏈對(duì)小的，高帶電肽好;另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。

典型的操作常由兩綬沖劑組成， 0.1%TFA-H2O 和 80% acetonitrile 0.1%TFA--H2O 稀 acetonitrile 。用線型梯變以每分鐘 0.5% 到 1.0% 改變的速度混合。常見(jiàn)分析和純化用柱為 4.6× 250mm (3-10μ m) 和 22× 250mm (10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是 8×100 ( 3-10μ m )和 25× 250mm (10μ m)

大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如 heptafluorobutyric 酸， 0.1% 磷酸， 稀 Heformic 酸 (5-6%, pH2-4), 10 -100mM NH4HCO3, 醋酸鈉 / 氨， TFA/TEA ，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點(diǎn)：硅反相柱料不能長(zhǎng)時(shí)間暴露于高 pH ，甚至微堿 pH ， 因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子

一般多肽分離拿150mm的柱子就可以了，250mm在分離度上改善不大，因?yàn)槎嚯牡姆蛛x機(jī)理和小分子不同。

小分子是通過(guò)液液交換，所以柱子越長(zhǎng)交換越充分，分離度也越高。

多肽在柱子上的保留和分離其實(shí)主要發(fā)生在柱頭，也就是說(shuō)，多肽先在柱頭都被保留下來(lái)，隨著梯度上升逐漸被洗脫，所以柱長(zhǎng)對(duì)多肽分離的影響比起其對(duì)小分子的分離度影響小得多。