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阿維菌素發(fā)酵過(guò)程糖含量測(cè)定三種方法比較

阿維菌素發(fā)酵過(guò)程糖含量測(cè)定三種方法比較

　　摘要：三種常用方法測(cè)阿維菌素發(fā)酵過(guò)程糖濃度,比較得出阿貝折光儀法操作簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，能夠控制發(fā)酵液糖的含量，利于發(fā)酵過(guò)程控制。

　　關(guān)鍵詞：阿維菌素;阿貝折光儀;糖含量

　　The Comparison of Three Methods on Measuring the Sugar Content of Abamectin Fermentation Process

　　Abstract: Comparing three methods on the sugar content of abamectin fermentation process,abbe refractometer method is simple ,fast, accurate,and able to control the sugar content of fermentation,which will conducive to the fermentation process control.

　　Keyword: abamectin; abbe refractometer; sugar content

　　阿維菌素是一種農(nóng)用獸用殺蟲(chóng)、殺螨劑，大環(huán)內(nèi)酯雙糖類抗生素化合物。由阿佛鏈霉菌經(jīng)二級(jí)生物發(fā)酵、化學(xué)提取、精制而成;阿維菌素的發(fā)酵工藝是通過(guò)一系列工藝參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些參數(shù)中包括一是物理參數(shù)，即溫度、壓力等,二是化學(xué)控制參數(shù)，即pH、糖的濃度等;其中糖的濃度是控制發(fā)酵過(guò)程中的重要參數(shù)之一;由于碳源對(duì)于發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)及阿維菌素合成都有較大影響。因此，測(cè)知發(fā)酵過(guò)程中糖濃度變化，對(duì)阿維菌素發(fā)酵控制有重要的指導(dǎo)意義， 因?yàn)樘菨舛茸兓�影響菌種在發(fā)酵過(guò)程阿維菌素效價(jià)的變化，效價(jià)是發(fā)酵產(chǎn)量重要指標(biāo)，效價(jià)低就意味著產(chǎn)量低。糖濃度低于控制指標(biāo)，得不到及時(shí)補(bǔ)給，發(fā)酵液的菌絲就會(huì)生產(chǎn)緩慢甚至停滯生長(zhǎng)，造成減產(chǎn)，為此對(duì)糖濃度檢測(cè)方法要簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，要及時(shí)滿足工藝要求。

　　測(cè)糖的方法有許多常用的有菲林法、3，5一二硝基水楊酸法(DNS)、阿貝折光儀。

　　測(cè)糖菲林法是在加熱條件下，直接滴定已標(biāo)定過(guò)的費(fèi)林氏液，費(fèi)林氏液被還原析出氧化亞銅后，過(guò)量的還原糖立即將次甲基藍(lán)還原，使藍(lán)色褪色，溶液的顏色變化過(guò)程為：淺藍(lán)色一棕色一磚紅色(沉淀)，根據(jù)樣品消耗體積，計(jì)算糖含量。

　　3，5一二硝基水楊酸法(DNS)是在堿性溶液中，還原糖變?yōu)橄┒�醇，烯二醇可�?，5一二硝基水楊酸氧化為糖酸，加熱進(jìn)一步產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在540 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)的深淺成一定比例關(guān)系。

　　阿貝折光儀測(cè)糖是利用光線折射的原理測(cè)定不同濃度糖的折光特性。

　　前兩種操作時(shí)間較長(zhǎng)，步驟多，而且樣品要經(jīng)除去蛋白質(zhì)后再測(cè)，存在人為因素對(duì)顏色變化的把握，同時(shí)要作平行樣，影響及時(shí)補(bǔ)糖，滯后工藝控制。作者查詢文獻(xiàn)得知國(guó)內(nèi)青霉素發(fā)酵、四環(huán)素發(fā)酵過(guò)程采用阿貝折光儀測(cè)糖，為此受到啟發(fā)，作者引用該儀器來(lái)測(cè)定阿維菌素的發(fā)酵過(guò)程糖的濃度，經(jīng)過(guò)三種方法的對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該儀器測(cè)定方法完全適合阿維菌素發(fā)酵過(guò)程糖濃度測(cè)定。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明阿貝折射法比菲林法、DNS測(cè)糖方法所用時(shí)間少，而且數(shù)據(jù)可靠，并能及時(shí)調(diào)整發(fā)酵過(guò)程中糖的濃度，滿足工藝要求。同時(shí)不需用化學(xué)試劑，減少對(duì)環(huán)境的污染，并節(jié)約了生產(chǎn)成本。

　　由于發(fā)酵工藝所需原輔料的質(zhì)量指標(biāo)是根據(jù)工藝要求而定，所以質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)企業(yè)可按照工藝要求而自定企業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)中發(fā)酵液的各種測(cè)定只要方法簡(jiǎn)捷、數(shù)據(jù)可靠，滿足工藝要求、符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)即可。

　　1 實(shí)驗(yàn)條件

　　1.1 儀器、設(shè)備、試劑

　　1.1.1 阿貝折光儀;潔凈工作臺(tái);恒溫恒濕搖床;分光光度計(jì)721,阿維菌素發(fā)酵液：實(shí)驗(yàn)室自;DNS法所用試劑：DNS顯色劑、有酒石酸鉀鈉、無(wú)水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、3，5一二硝基水楊酸、葡萄糖、碘一碘化鉀;菲林發(fā)所用試劑：氫氧化鈉、硫酸銅、葡糖糖。

　　1.2 測(cè)樣條件

　　溫度25℃;純化水折射率1.3325;光源白光。

　　1.3 實(shí)驗(yàn)部分

　　1.3.1 發(fā)酵液處理與測(cè)樣配制阿維菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基(20100921，20100922 ，20100923)三批各60瓶，使用1000 mL的三角瓶，每瓶裝量為500 mL，消毒后溫度降至與發(fā)酵培養(yǎng)一致的溫度28℃，然后無(wú)菌接種，三批發(fā)酵液分別放置三臺(tái)搖瓶機(jī)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),溫度、濕度、轉(zhuǎn)數(shù)控制在于生產(chǎn)工藝規(guī)定的范圍內(nèi)。所取發(fā)酵液樣用濾紙過(guò)濾到試管里，取濾液滴到折光儀測(cè)試點(diǎn)，并讀數(shù);同時(shí)按菲林法和3,5-二硝基水楊酸(DNS)測(cè)發(fā)酵液糖濃度。

　　1.3.2 樣品測(cè)定

　　1.3.2.1 折光法 取過(guò)濾法后阿維菌素發(fā)酵液用干凈滴管加在折射棱鏡表面，并讀數(shù)。

　　1.3.2.2 菲林法吸取費(fèi)林試劑甲液(0.1 g/mL氫氧化鈉溶液)及乙液(O.05 g/mL硫酸銅)各5.O0 mL，置于錐形瓶中，加蒸餾水10 mL，加玻璃珠3粒，從滴定管中加入比與測(cè)試樣品溶液消耗的總體積少1 mL的過(guò)濾后發(fā)酵液，加熱使其在2 min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁熱以每2s 1滴的速度繼續(xù)滴加樣液，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗樣品溶液的總體積，平行操作取其平均值。

　　1.3.2.3 DNS法先繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，取適量阿維菌素發(fā)酵液于離心管中，3 500 r/min離心15 min，取上清液加人25 mL容量瓶中，加入DNS試劑5 mL沸水浴5 min，冷水冷卻后定容，以空白作對(duì)照測(cè)定520nm波長(zhǎng)下的吸光度。

　　1.3.3 數(shù)據(jù)分析 連續(xù)三批阿維菌素發(fā)酵情況良好，發(fā)酵過(guò)程糖消耗速率正常，菌絲生長(zhǎng)正常，將三批發(fā)酵在相同發(fā)酵周期內(nèi)，用三種不同方法測(cè)得糖含量數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別對(duì)三種方法進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 計(jì)算得出阿貝折光儀測(cè)糖相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD是2.58%，菲林法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD是2.43%，DNS法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD是2.09%。

　　1.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在同樣實(shí)驗(yàn)條件下，得出阿貝折光法、DNS和菲林法對(duì)阿維菌素連續(xù)三批發(fā)酵液樣中糖含量的數(shù)據(jù)結(jié)果接近，沒(méi)有大的差異，RSD數(shù)據(jù)顯示三種方法的精密度與準(zhǔn)確度都能夠保證阿維菌素發(fā)酵液的糖濃度含量，比較而言阿貝折光法時(shí)間短，只需3分鐘，操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，不需要繪制DNS的標(biāo)準(zhǔn)曲線，不需要菲林試劑的配制，能及時(shí)滿足工藝要求，可 隨時(shí)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果及時(shí)調(diào)整發(fā)酵液中糖的含量，對(duì)阿維菌素菌種生長(zhǎng)有利，菌絲衰老過(guò)程得到控制，分泌阿維菌素量提高。在這樣的前提條件下，產(chǎn)量得到了提高。阿貝折光法適合大規(guī)模的生產(chǎn)，并且檢驗(yàn)人員容易掌握。而DNS、菲林法約需40 min，操作環(huán)節(jié)復(fù)雜、檢驗(yàn)成本較高。

　　2 討論

　　2.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的注意事項(xiàng)

　　環(huán)境的溫度、發(fā)酵液的溫度對(duì)測(cè)樣的數(shù)據(jù)影響較大，一定要嚴(yán)格控制按照儀器使用方法進(jìn)行操作，將發(fā)酵液的溫度和環(huán)境溫度控制在25℃在開(kāi)始測(cè)樣，因?yàn)槲镔|(zhì)的折射率與密度有關(guān)，溫度不同，密度不同，所以在不同的溫度下測(cè)定同一樣品的折射率是不同的，溫度高所測(cè)糖濃度偏低，溫度低測(cè)糖濃度會(huì)偏高。

　　2.2 實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)用

　　通過(guò)三種方法比較，DNS、菲林法操作步驟多多，得出阿貝折光儀用于阿維菌素生產(chǎn)中間體檢驗(yàn)，間單快捷、數(shù)據(jù)出具及時(shí)準(zhǔn)確，能正確指導(dǎo)發(fā)酵工藝人員對(duì)發(fā)酵狀況做出正確判斷。并減輕化驗(yàn)員的勞動(dòng)強(qiáng)度�；�驗(yàn)崗位的試劑使用量減少，不用配制菲林試液并進(jìn)行標(biāo)定，不用再定期繪制DNS法糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，在生產(chǎn)過(guò)程中檢驗(yàn)試劑的排放減少，減輕對(duì)環(huán)境的污染程度。生產(chǎn)過(guò)程中，可以定期對(duì)阿貝折光儀所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行菲林法、DNS法做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，觀察數(shù)據(jù)有否偏離。