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固相萃取-高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中的幾種芳胺

固相萃取-高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中的幾種芳胺

　　摘 要:研究了用固相萃取富集和高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中的幾種芳胺(苯胺、對甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、1-萘胺、2-萘胺和4-氨基聯(lián)苯)的方法，環(huán)境水樣中的芳胺用1-萘酚衍生生成偶氮染料，偶氮染料用Waters Sep-Pak-C18 固相萃取小柱固相萃取富集，然后以Waters XterraTMRP18(3.9×150mm, 5μm)色譜柱為固定相，82%的甲醇(內(nèi)含0.01mol/L pH=8 的四氫吡咯-醋酸緩沖鹽)為流動相分離，二極管陣列檢測器檢測測定;苯胺、對甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、4-氨基聯(lián)苯、1-萘胺和2-萘胺的檢測限分別為0.8、0.6、0.6、0.6、0.4 和0.4 μg/L。幾種芳胺的相對標準偏差在2.1%～2.6%之間，標準回收率在93%～106%之間，方法用于環(huán)境水樣中幾種芳胺的測定，結(jié)果令人滿意。

　　關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 固相萃取芳胺

　　芳胺是一類重要的環(huán)境污染物，是環(huán)保衛(wèi)生部門的重要檢測指標[1,2]。芳胺的測定方法主要有光度法、電化學(xué)法、色譜法等，其中高效液相色譜法是最常用的方法。但是對于許多復(fù)雜環(huán)境樣品，芳胺的含量只是微克級，而且樣品中還存在大量其它有紫外吸收的物質(zhì)，這些物質(zhì)很難和芳胺完全分離，會干擾芳胺的測定。為了能有選擇性地測定環(huán)境水樣中的芳胺，研究了用1-萘酚衍生，讓1-萘酚和芳胺重氮偶合生成偶氮染料，然后用固相萃取富集、高效液相色譜分離測定芳胺的方法。由于該方法采用了1-萘酚衍生，衍生反應(yīng)對芳胺是特效的，且衍生后生成的幾種偶氮染料最大吸收波長在460～500nm之間，該波長下樣品中其它有紫外吸收的物質(zhì)無吸收，不干擾芳胺的測定，方法選擇性大大增加。結(jié)合固相萃取對待測組分的高倍數(shù)富集，該方法可準確測定環(huán)境樣品中μg/L 級的幾種主要芳胺。

　　1 實驗部分

　　1.1 主要儀器和試劑

　　濟南海能儀器公司高效液相色譜儀，包括LC7010四元泵\LC7050自動進樣器，LC7060二極管陣列檢測器，Hanon-Clarity色譜管理軟件;苯胺、1-萘胺、2-萘胺、對甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺和4-氨基聯(lián)苯標樣(含量≥99%，購于Fluka 公司)，用50%乙醇-水溶液配成1.0mg/mL 的儲備液，使用時用50%乙醇-水溶液稀釋成1.0μg/mL 的標準工作液;1-萘酚溶液：2.0%(w/v)，用50%乙醇-水溶液配制;硫酸氫鉀(KHSO4)溶液：5%(w/v)，用水配制;亞硝酸鈉溶液：5%(w/v)，用水配制;氨基磺酸銨溶液：2.5%(w/v)，用水配制;氫氧化鈉溶液：3mol/L，用水配制;甲醇：高效液相色譜專用(Fisher 公司生產(chǎn));實驗用水為石英亞沸蒸餾水并用Milli-Q50(Millipore 公司)超純水儀處理，電阻>18 MΩ·cm-1。

　　1.2 色譜條件

　　色譜柱為 RP18 液相色譜柱(3.9×150mm, 5μm);固相萃取柱為C18 固相萃取小柱(填料為十八烷基鍵合硅膠，粒度30μm，柱腔容積為1mL，萃取容量為30mg);流動相為82%的甲醇(內(nèi)含0.01mol/L pH=8 的四氫吡咯-醋酸緩沖鹽)，流速0.5mL/min;進樣體積20μL。在該色譜條件下標準品和水樣在480nm 波長下的色譜圖見圖1。

　　1.3 測定方法

　　根據(jù)樣品中芳胺含量，酌情取適量水樣于100mL 錐形瓶中，用5%的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1.5～2.0(用精密pH 試紙測試)后，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.1mL，充分搖勻，放置5min;然后加入2.5%的氨基磺酸銨溶液0.5mL，充分振蕩至氣泡消除(消除過量亞硝酸鈉的影響)，然后再加入2%的1-萘酚溶液3mL 和3mol/L 的氫氧化鈉溶液2.5mL，充分搖勻，定容到100mL，該有色溶液以20mL/mim 的流速通過活化好的固相萃取小柱，過完柱后小柱上富集的待測組份用2.0mL 的乙醇以5mL/min 的流速洗脫;洗脫液用0.45μm 的針頭過濾器過濾，進樣20μL 分析。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 柱前衍生條件

　　由于復(fù)雜水樣中含有大量的其它有紫外吸收的物質(zhì)，如果不經(jīng)衍生直接分析，樣品中的芳胺無法和這些成分完全分離，會嚴重干擾芳胺的測定。因此采用柱前衍生的方法讓芳胺生成偶氮染料，衍生反應(yīng)對芳胺是特效的，而且生成的偶氮染料最大吸收波長紅移到460～500nm 之間，在該波長下其它有紫外吸收的干擾組分無吸收，在色譜上不出峰，不干擾芳胺的測定，方法選擇性得到很大提高。芳胺的衍生劑常用的有8-羥基喹啉、1-萘酚、鄰甲氧基苯酚和N-(1-萘基)乙二胺等，對幾種試劑作了比較，效果以1-萘酚最好，因此本實驗選用1-萘酚作為芳胺的衍生試劑。衍生條件參照文獻，芳胺先在硫氫酸鉀和亞硝酸鈉介質(zhì)中生成重氮鹽，用氨基磺酸胺分解過量的亞硝酸鈉，然后在堿性條件下和1-萘酚重氮偶聯(lián)即可生成偶氮染料。重氮化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為用5%的硫酸氫鉀溶液將水樣pH 調(diào)節(jié)至1.5～2.0 后加入5%的亞硝酸鈉溶液0.1mL，反應(yīng)5min 可完全;重氮化反應(yīng)完全后可和1-萘酚偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)的最佳條件為加入3mL 2%(w/v)的1-萘酚，在pH 8.2～13.5 范圍內(nèi)進行偶聯(lián)，通過加入3mol/L 的氫氧化鈉溶液2.5mL 控制偶聯(lián)反應(yīng)在該pH 范圍。實驗表明偶聯(lián)反應(yīng)瞬間可反應(yīng)完全，而且生成的偶氮染料在放置10h 后吸光度不變，說明偶氮染料生成后至少可穩(wěn)定10h。

　　2.2 固相萃取條件選擇

　　環(huán)境水樣中的芳胺含量很低，只在μg 級，不經(jīng)富集很難用液相色譜法準確測定。由于用溶劑萃取法富集誤差較大，操作麻煩，且易污染環(huán)境，因此本實驗采用固相萃取法富集。小柱對芳胺衍生后生成的偶氮染料的固相萃取可用疏水締合原理解釋。即偶氮染料具有一定的疏水性，以水溶液通過小柱時能富集在小柱上，改用少量溶劑強度大的溶劑(乙醇、乙腈、四氫呋喃等)洗脫就能把絡(luò)合物洗下而達到富集。用Waters SPE 真空提取裝置，每次可同時處理20 個樣，小柱活化和樣品富集的流速均為20mL/min，小柱用2mL 乙醇活化，再用10mL 水洗去殘留的乙醇;樣品(有色溶液)以20mL/min 的流速通過小柱(廠家提供小柱對待富集物的參考萃取容量為30mg，而樣品中的芳胺含量只為微克級，因此不會超過小柱的萃取容量)，通過小柱后的流出液為無色，而且收集流出液再萃取一次也未見小柱上有紅色物質(zhì)保留，說明一次固相萃取就能完全萃取生成的偶氮染料。樣品富集完后可用洗脫劑洗脫，實驗了不同洗脫劑洗脫小柱上的有色絡(luò)合物，用乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃、甲醇等極性有機溶劑均可使小柱上富集的偶氮染料完全洗下。在幾種溶劑中由于乙醇揮發(fā)性弱、無毒且價格便宜，因此實驗選用乙醇作洗脫劑，乙醇用量在2.0mL左右即可把小柱上富集的絡(luò)合物完全洗下。

　　2.3 色譜分離條件的選擇

　　實驗表明，用82%的甲醇作流動相，六種芳胺衍生生成的偶氮染料可達到完全分離。但是，芳胺衍生生成的偶氮染料有酸式和堿式兩種結(jié)構(gòu)，pH≤5.4 時以酸式結(jié)構(gòu)存在，為黃色，pH≥5.4時以堿式存在，為紅色，堿式結(jié)構(gòu)具有更高的靈敏度和更好的峰形，因此實驗選擇在流動相中加入0.01mol/L pH=8 的四氫吡咯-醋酸緩沖鹽，保持偶氮染料在分離過程中以堿式結(jié)構(gòu)存在。

　　2.4 色譜峰的識別和檢測波長的選擇

　　樣品中各芳胺的色譜峰均由其保留時間及二極管陣列檢測器400～650nm波長掃描所得光譜圖與標樣對照確認，并作了色譜峰純度分辨，證明各芳胺均達到完全分離，無重疊峰，各芳胺衍生后生成的偶氮染料的吸收曲線見圖2;為了獲得最高靈敏度，各成分均在最大吸收波長下檢測。

　　2.5 工作曲線

　　用峰面積定量法得工作曲線，進樣量為20μL 時，根據(jù)信燥比S/N=3，算得各組分的檢測限，結(jié)果見表1。表中A 為峰面積，C 單位為(μg/mL)。

　　清潔水樣可直接按測定方法測定，混濁水樣需用鹽酸酸化后濾去懸浮物或殘渣，再按測定方法測定。水樣每種等量取兩份，其中一份加入1μg 的苯胺、對甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、4-氨基聯(lián)苯、1-萘胺、2-萘胺標樣，另一份不加，按測定方法測定，每種平行測定5 次，計算5 次平行測定結(jié)果的相對標準偏差，并按加標樣品測出量減去未加標樣品測出量再除以標準加入量計算平均回收率，結(jié)果(扣除試劑空白)見表2。

　　3 結(jié)論

　　用1-萘酚衍生環(huán)境水樣中的幾種芳胺生成偶氮染料，用固相萃取富集偶氮染料，二極管陣列檢測器檢測測定了環(huán)境水樣中的幾種芳胺。由于采用了1-萘酚衍生，衍生反應(yīng)對芳胺是特效的，且衍生后生成的幾種偶氮染料最大吸收波長在460～500nm 之間，該波長下樣品中其它有紫外吸收的物質(zhì)無吸收，不干擾芳胺的測定，方法選擇性大大增加。采用固相萃取富集，富集倍數(shù)可達50 倍，方法靈敏度大大提高;對于環(huán)境樣品中μg/L 級的幾種主要芳胺，相對標準偏差在2.1%～2.6%之間，標準回收率在93%～106%，結(jié)果滿意。該方法的建立為水樣中的芳胺測定提供了新方法。