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摘要：本文主要針對應(yīng)用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理及其具體的消化、蒸餾和滴定過程中的各個(gè)細(xì)節(jié)及其相應(yīng)的注意事項(xiàng)進(jìn)行總結(jié)，為從事蛋白質(zhì)測定工作的檢測人員提供參考和幫助。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)  測定原理  注意事項(xiàng)

 

              Zhangguozhi   Jinan Hanon Instruments Co., Ltd

 

Abstracts:  This article mainly aimed at Mirco-Kjeldahl determination methods and the digestion, distillation and titration process. Summarized the experimental details and their corresponding notes.for the inspection staff in such work provides reference and help.

key word: Protein, nitrogen determination, notes

 

 

以凱氏定氮法測定氮含量換算蛋白質(zhì)的方法，是國際上通用的標(biāo)準(zhǔn)方法，操作簡單，測定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好，廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為半微量凱氏定氮法。其測定原理相同，主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但微量法的準(zhǔn)確度和精密度比常量法要差一些。凱氏定氮法整個(gè)測定過程分為消解、蒸餾、滴定三步。

要使測定結(jié)果有更好的正確度、準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度，認(rèn)真細(xì)致掌握測定的每個(gè)步驟、各個(gè)細(xì)節(jié)及相應(yīng)的注意事項(xiàng)，就顯得尤為重要。本文就此進(jìn)行深入的探討。

 

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。樣品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

1.消化

　有機(jī)物中的胺根在強(qiáng)熱和CuSO₄，濃H₂SO₄ 作用下，硝化生成(NH₄)₂SO₄

　　反應(yīng)式為：

2NH₂^—+H₂S0₄+2H⁺＝(NH₄)₂S0₄ （其中CuSO₄做催化劑）

2.蒸餾

　在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH₃ ，收集于H₃BO₃ 溶液中

　　反應(yīng)式為:

　　(NH₄)₂SO₄+2NaOH＝2NH₃+2H₂O+Na₂SO₄

2NH₃+4H₃BO₃＝(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

3.滴定

用已知濃度的H₂SO₄（或HCI）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量

　　反應(yīng)式為：

　　(NH₄)₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O＝(NH₄)₂SO₄+4H₃BO₃

　　(NH4)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O＝2NH₄Cl+4H₃BO₃

 

 40%氫氧化鈉：化學(xué)純 400g氫氧化鈉溶于1000ml無氨蒸餾水中。

2%硼酸：分析純 20g硼酸溶于1000ml無氨蒸餾水中。

0.05mol/L鹽酸：分析純 4.2ml鹽酸定容至1000ml，通過無水碳酸鈉標(biāo)定。

 

混合指示劑：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚綠溶液5份和溶于95％乙醇的0.l％

甲基紅溶液1份混合而成．

（1）  樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。

固體樣品一般取樣范圍為0.20g~2.00g；半固體試樣一般取樣范圍為2.00g~5.00g；液體樣品取樣10.0mL~25.0mL（約相當(dāng)?shù)?0mg~40mg）。若檢測液體樣品，結(jié)果以g/100mL表示。

 樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。

（2） 樣品放入定氮瓶內(nèi)時(shí)，不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低，或者用濾紙包裹好一起投入消化，濾紙影響通過空白扣除。消化時(shí)應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。

（3）消化時(shí)，不要用強(qiáng)火。若樣品含糖高或含脂及較多時(shí)，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失�？杉尤肷倭啃链蓟蛞后w石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。在整個(gè)消化過程中保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。海能公司消解爐SH220或SH520能夠很好的解決此問題。

（4）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這樣會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時(shí)，要增加硫酸的量；加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點(diǎn)；催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后，溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色，可用它來指示消化終點(diǎn)。此外，硫酸銅還可用做下一步蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。  過氧化氫，為氧化劑，有助于有機(jī)物消化，同時(shí)可以消除消化過程中的氣泡現(xiàn)象。

（5）向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀物，這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時(shí)銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物[Cu(NH₃)₄]²⁺ ， 加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個(gè)測定的順利進(jìn)行。由反應(yīng)原理可知，當(dāng)氫氧化鈉足量時(shí)有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色；當(dāng)氫氧化鈉量不足時(shí)就無黑色氧化銅產(chǎn)生而使溶液呈淡藍(lán)色，所以有無氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標(biāo)志。

（6）因蒸餾時(shí)反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時(shí)，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得停火斷氣，否則，會(huì)發(fā)生倒吸。停止蒸餾時(shí)，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層，所以，操作時(shí)，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否完全，可用精密ＰＨ試紙測冷凝管口的冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾完全。一般情況下建議使用半微量法，因?yàn)槿绻�蒸餾失敗的話，半微量法還可繼續(xù)蒸餾，而常量法只好全部重來，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。我們使用海能K9840經(jīng)過多次蒸餾吸收實(shí)驗(yàn)達(dá)到理想效果。

（7）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

（8）吸收液也可以用0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，而以硼酸為氨的吸收液，可省去標(biāo)定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴(yán)格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。另外，硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結(jié)果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。

（9）在鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制時(shí)，必須將基準(zhǔn)無水碳酸鈉于270-300℃灼燒至恒重后稱取所須用量，否則也會(huì)影響蛋白質(zhì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，常量法中取0.1M比較合適，半微量法中則在0.02～0.05M之間比較合適。

 

凱氏定氮法作為目前法定的國標(biāo)方法與我們的工作密不可分，本文主要通過綜述凱氏定氮法操作的細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)，為關(guān)注此檢測方法的從業(yè)人員提供一定的幫助，從而有效的提高效率。

 

[1]GB 5009.5-2010 食品中蛋白質(zhì)的測定 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.3.26

[2]寇云娟，譚源，韓起文. 牛奶中蛋白質(zhì)的測定原理及其注意事項(xiàng)<<中國乳業(yè)>>2006，7.

[3]蛋白質(zhì)測定實(shí)驗(yàn)研究[J]實(shí)驗(yàn)室研究與探討，2005, 24(4): 58-59