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化妝品中7種常見抗生素的超快速液相色譜測定法

化妝品中7種常見抗生素的超快速液相色譜測定法

　　抗生素屬于處方藥，我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[1(] 以下簡稱《規(guī)范》)規(guī)定此類物質(zhì)為禁用成分，然而市場抽檢往往會有檢出[2-4]。國內(nèi)對化妝品中7 種常見抗生素(鹽酸米諾環(huán)素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素及甲硝唑)的檢測方法多采用高效液相色譜法(HPLC)[5-7]，2007 版《規(guī)范》也是采用HPLC 法。超快速液相色譜(UFLC)是近2 年來新發(fā)展的液相色譜技術(shù)，代表了液相色譜發(fā)展方向。本研究建立了UFLC 法同時(shí)測定化妝品中7 種常見抗生素的方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　LC7000(海能儀器股份有限公司);鹽酸四環(huán)素(97.5%)、鹽酸金霉素(99.0%)、氯霉素(98.5%)及甲硝唑(99.4%)標(biāo)準(zhǔn)品，鹽酸米諾環(huán)素(85.1%)、鹽酸土霉素(88.2%)、鹽酸多西環(huán)素(86.0%);甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純;超純水。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色譜條件色譜柱為 C18 柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動相A 為甲醇-乙腈(體積比為1∶2)，流動相B 為1%甲酸水溶液，采用梯度洗脫，初始時(shí)流動相A 體積分?jǐn)?shù)為10%，至3.5 min 線性增長至30%，然后保持1.5 min，5.0 min后恢復(fù)初始流動相，平衡1.5 min 結(jié)束，流量為0.2 ml/min;檢測波長為268 nm;進(jìn)樣量為2 μl。

　　1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制單標(biāo)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約10 mg 分別至10.0 ml 容量瓶中，用1 ml 甲醇及1 ml 1%甲酸水溶液溶解，甲醇定容至刻度，各單標(biāo)濃度約為1 mg/ml。校準(zhǔn)曲線：根據(jù)所需標(biāo)樣濃度，移取適量各單標(biāo)中間液于10.0 ml 容量瓶中，流動相定容，標(biāo)準(zhǔn)系列為1、2、5、10、50 mg/L，臨用現(xiàn)配。

　　以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。

　　1.2.3 樣品前處理提取方法借鑒《規(guī)范》[1]，但考慮到氯離子對儀器有一定的腐蝕性，用甲酸替代鹽酸。即：稱取化妝品樣品1.00 g 于10 ml 具塞比色管中，加入甲醇和甲酸(1%)等體積混合溶液至刻度，搖勻，超聲提取20 min，必要時(shí)于離心機(jī)上以1610 離心5 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾得到待測液，在設(shè)定色譜條件下上機(jī)分析。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 流動相及洗脫條件的選擇

　　流動相優(yōu)化：流動相中的有機(jī)相選擇借鑒了《規(guī)范》[1]。四環(huán)素類化合物屬于兩性化合物，從色譜理論上講，流動相可以是酸性或堿性，但由于鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素在堿性條件下易破壞失效[8]，所以選擇酸性流動相。隨著改變流動相中甲酸含量分別為0.1%，0.2%，0.5%和1.0%，發(fā)現(xiàn)甲硝唑的保留時(shí)間逐步變化，當(dāng)甲酸含量為1.0%時(shí)，保留時(shí)間逐步達(dá)到穩(wěn)定，方法的重現(xiàn)性和耐用性最佳。由于7 種化合物的極性差別大，所以宜采用梯度洗脫方式。另外，試驗(yàn)顯示采用梯度洗脫比等度洗脫更能提高目標(biāo)物質(zhì)的檢測靈敏度。圖1 為7 種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，各化合物在5 min 內(nèi)得到分離，其保留時(shí)間見表1。

　　2.2 方法的線性范圍和檢出限

　　在設(shè)定色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的絕對質(zhì)量與色譜峰面積呈線性相關(guān)。檢測下限以噪音的3 倍計(jì)算。7 種抗生素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及儀器檢出限見表l。

　　2.3 準(zhǔn)確度與精密度

　　向不含待測7 種物質(zhì)的祛痘除螨類樣品中分別加入高低兩種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)量分別為5 和20 mg/kg，混勻過夜，依照前述樣品處理方法提取測定，每個(gè)添加水平平行測定6份。7 種抗生素的平均回收率為82.5%~105.0%，RSD 為0.4%~4.8%(n=6)。7 種抗生素的精密度及準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。

　　2.4 實(shí)際樣品測定

　　對11 份市售祛痘除螨類化妝品的分析表明，2 份檢出氯霉素，檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.37% 和0.19%;1 份檢出甲硝唑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.02%;鹽酸米諾環(huán)素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素未檢出。圖2 為同時(shí)檢出甲硝唑和氯霉素的某陽性樣品色譜圖，峰2 保留時(shí)間為1.35 min，為雜質(zhì)出峰，不影響對峰1 甲硝唑的定性。

　　3 小結(jié)

　　本研究建立了化妝品中7 種常見抗生素的UFLC 檢測方法，與已報(bào)道的HPLC 方法比較，該方法檢驗(yàn)速度更快，檢出限更低，廢液排放少，其他方法學(xué)參數(shù)都能達(dá)到要求。