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土壤全氮量的測(cè)定

　　1、方法概述

　　測(cè)定土壤全氮量的方法主要可分為干燒法和濕燒法兩類。

　　干燒法是杜馬斯(Dumas)于1831年創(chuàng)立的，又稱為杜氏法。其基本過程是把樣品放在燃燒管中，以600℃以上的高溫與氧化銅一起燃燒，燃燒時(shí)通以凈化的CO2氣，燃燒過程中產(chǎn)生的氧化亞氮(主要是N2O)氣體通過灼熱的銅還原為氮?dú)?N2)，產(chǎn)生的CO則通過氧化銅轉(zhuǎn)化為CO2，使N2和CO2的混合氣體通過濃的氫氧化鉀溶液，以除去CO2，然后在氮素計(jì)中測(cè)定氮?dú)怏w積。

　　杜氏法不僅費(fèi)時(shí)，而且操作復(fù)雜，需要專門的儀器，但是一般認(rèn)為與濕燒法比較，干燒法測(cè)定的氮較為完全。

　　濕燒法就是常用的開氏法。這個(gè)方法是丹麥人開道爾(J.Kjeldahl)于1883年用于研究蛋白質(zhì)變化的,后來被用來測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮.由于設(shè)備比較簡(jiǎn)單易得,結(jié)果可靠,為一般實(shí)驗(yàn)室所采用.此方法的主要原理是用濃硫酸消煮,借催化劑和增溫劑等加速有機(jī)質(zhì)的分解,并使有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨進(jìn)入溶液,最后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定蒸餾出的氨。

　　此方法進(jìn)行了許多改進(jìn)，一是用更有效的加速劑縮短消化時(shí)間;二是改進(jìn)了氨的蒸餾和測(cè)定方法，以提高測(cè)定效率。

　　在開氏法中，通常都用加速劑來加速消煮過程。加速劑的成分按其效用的不同，可分為增溫劑、催化劑和氧化劑等三類。

　　常用的增溫劑主要是硫酸鉀和硫酸鈉。在消煮過程中溫度起著重要作用。消煮時(shí)的溫度要求控制在360～410℃之間，低于360℃，消化不容易完全，特別是雜環(huán)氮化合物不易分解，使結(jié)果偏低，高于410℃則容易引起氨的損失。溫度的高低受加入硫酸鉀的量所控制，如果加入的硫酸鉀較少(每毫克硫酸加硫酸鉀0.3g)，則需要較長(zhǎng)時(shí)間才能消化完全。如果加入的硫酸鉀較多，則消化時(shí)間可以大大縮短，但是當(dāng)鹽的質(zhì)量濃度超過0.8g·mL-1時(shí)，則消化完畢后，內(nèi)容物冷卻結(jié)塊，給操作帶來一些困難。因此，消煮過程中鹽的濃度應(yīng)控制在0.35～0.45g·mL-1,在消煮過程中如果硫酸消耗過多，則將影響鹽的濃度，一般在開氏瓶口插入一小漏斗，以減少硫酸的損失。

　　開氏法中應(yīng)用的催化劑種類很多。事實(shí)上多年來人們致力于開氏法的改進(jìn)，多數(shù)集中在催化劑的研究上。目前應(yīng)用的催化劑主要有Hg、HgO、CuSO4、FeSO4、Se、TiO2等，其中以CuSO4和Se混合使用最普遍。

　　Hg和Se的催化能力都很強(qiáng)，但在測(cè)定過程中，Se會(huì)帶來一些操作上的困難。因?yàn)镠gO能與銨結(jié)合生成汞—銨復(fù)合物。這些包含在復(fù)合物中的銨，加堿蒸餾不出來，因此，在蒸餾之前，必須加硫代硫酸鈉將汞沉淀出來。

　　HgO+(NH4)2SO4=[Hg(NH3)2]SO4+H2O

　　[Hg(NH3)2]SO4+Na2S2O3+ H2O=HgS+Na2SO4+(NH4)2SO4

　　產(chǎn)生的黑色沉淀(HgS)會(huì)使蒸餾器不易保持清潔，且汞有毒，污染環(huán)境，因此在開氏法中，人們不喜歡用汞作催化劑。

　　硒的催化作用最強(qiáng)，但必須注意，用硒粉作催化劑時(shí)，開氏瓶中溶液剛剛清澈并不表示所有的氮均已轉(zhuǎn)化為銨。由于硒也有毒性，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ISO11261：1995)改用氧化鈦(TiO2)代替硒，其加速劑的組成和比例為K2 SO4:Cu SO4·5H2O:TiO2=100:3:3。

　　近年來氧化劑的使用特別是高氯酸又引起人們的重視。因?yàn)镠ClO4—H2SO4的消煮液可以同時(shí)測(cè)定氮、磷等多種元素，有利于自動(dòng)化裝置的使用。但是，由于氧化劑的作用過于激烈，容易造成氮的損失，使測(cè)定結(jié)果很不穩(wěn)定，所以，它不是測(cè)定全氮的可靠方法。

　　目前在土壤全氮測(cè)定中，一般認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的開氏法為：稱1.0～10.0g土樣(常用量)，加混合加速劑K2SO410g，CuSO41.0g，Se0.1g，再加濃硫酸30mL，消煮5h。為了縮短消煮時(shí)間和節(jié)省試劑，自20世紀(jì)60年代至今廣泛采用半微量開氏法(0.2～1.0g土樣)。

　　開氏法測(cè)定的土壤全氮并不完全包括NO3-—N和NO2—N，由于它們含量一般都比較低，對(duì)土壤全氮量的測(cè)定影響也小，因此可以忽略。但是，如果土壤中含有顯著數(shù)量的NO3-—N和NO2—N，則須用改進(jìn)的開氏法。

　　消煮液中的氮以銨的形態(tài)存在，可以用蒸餾滴定法、擴(kuò)散法或比色法等測(cè)定。最常用的是蒸餾滴定法，即加堿蒸餾，使氨釋放出來，用硼酸溶液吸收，而后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定之。蒸餾設(shè)備用半微量蒸餾器，對(duì)于半微量蒸餾器，近年來也有不少研究和改進(jìn)，現(xiàn)在除了用電爐加熱和蒸汽加熱各種單套半微量蒸餾器外，還有多套半微量蒸餾器聯(lián)合裝置，即一個(gè)蒸汽發(fā)生器可同時(shí)帶四套定氮裝置，既省電，又提高了功效，頗受科研工作者的歡迎。

　　擴(kuò)散法是用擴(kuò)散皿(即Conway皿)進(jìn)行的。皿分為內(nèi)外兩定(如圖4-1)，外室盛有消化液，內(nèi)室盛硼酸溶液，加堿液于外室后，立即密封，使氨擴(kuò)散到內(nèi)室被硼酸溶液吸收，最后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定之。有人認(rèn)為擴(kuò)散法的準(zhǔn)確度和精密度大致和蒸餾法相似，但擴(kuò)散法設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑用量少，操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，適于大批樣品的分析。

　　比色法適用于自動(dòng)裝置，但自動(dòng)比色分析應(yīng)有一個(gè)比較靈活的顯色反應(yīng)。縣在顯色反應(yīng)中不應(yīng)有沉淀、過濾等步驟。氨的比色分析，以靛酚藍(lán)比色法最靈敏，干擾也較少。連續(xù)流動(dòng)分析(CFA)中銨的分析采用靛酚藍(lán)比色法。

　　土壤氮的測(cè)定是重要的常規(guī)測(cè)試項(xiàng)目之一。因此，許多國(guó)家都致力于研制氮素測(cè)定的自動(dòng)、半自動(dòng)分析儀。目前國(guó)內(nèi)外已有不少型號(hào)的定氮儀。

　　利用干燒法原理研制的自動(dòng)定氮儀，有的可進(jìn)行許多樣品的連續(xù)燃燒，使各樣品的氮全部還原成氮?dú)�，徹底清除廢氣后，使氮?dú)膺M(jìn)入精確的注射管，自動(dòng)測(cè)定其容(μL)，例如Cole-man29-29A氮素自動(dòng)分析儀以及德國(guó)的N-A型快速定氮儀;有的則不清除CO2，而同時(shí)將N2和CO2送入熱導(dǎo)池探測(cè)器，利用N2和CO2的導(dǎo)熱系數(shù)不同，而同時(shí)測(cè)定N2和CO2(例如Leco Corporation, CR-412, CHN600, CHN1000型等)。

　　利用濕燒法的自動(dòng)定氮儀，實(shí)際上是開氏法的組裝，所用試劑藥品也同開氏法。它可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品消煮，它的蒸餾、滴定及結(jié)果的計(jì)算等步驟均系自動(dòng)快速進(jìn)行。分析結(jié)果能同時(shí)數(shù)字顯示并打印出來。

　　2、土壤全氮測(cè)定 ---半微量開氏法

　　2.1方法原理

　　樣品在加速劑的參與下，用濃硫酸消煮時(shí)，各種含氮有機(jī)物，經(jīng)過復(fù)雜的高溫分解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。堿化后蒸餾出來的氨用硼酸吸收，以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，求出土壤全氮量(不包括全部硝態(tài)氮)。

　　包括硝態(tài)和亞硝態(tài)氮的全氮測(cè)定，在樣品消煮前，需先用高錳酸鉀將樣品中的亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮后，再用還原鐵粉使全部硝態(tài)氮還原，轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮。

　　在高溫下硫酸是一種強(qiáng)氧化劑，能氧化有機(jī)化合物中的碳，生成CO2，從而分解有機(jī)質(zhì)。

　　2H2SO4+C→2H2O+2SO2↑+ CO2↑高溫

　　樣品中的含氮有機(jī)化合物，如蛋白質(zhì)在濃H2SO4的作用下，水解成為氨基酸，氨基酸又在H2SO4的脫氨作用下，還原成氨，氨與H2SO4結(jié)合成為硫酸銨留在溶液中。

　　Se的催化過程如下：

　　2H2SO4+Se→H2SeO3+2SO2↑+ H2O

　　亞硒酸

　　H2SeO3→SeO2+H2O

　　SeO2+C→Se+CO2

　　由于Se的催化效能高，一般常量法Se粉用量不超過0.1～0.2g，如用量過多則將引起氮的損失。

　　(NH4)2SO4+H2SeO3→(NH4)2 SeO3+H2SO4

　　3(NH4)2 SeO3→2NH3+3Se+9H2O+2N2↑

　　以Se作催化劑的消煮液，也不能用于氮磷聯(lián)合測(cè)定。硒是一種有毒元素，在消化過程中，放出H2Se。H2Se的毒性較H2S更大，易引起人中毒。所以，實(shí)驗(yàn)室要有良好的通風(fēng)設(shè)備，方可使用這種催化劑。

　　4CuSO4+3C+2H2SO4→2Cu2SO4+4SO2↑+3CO2↑+2H2O

　　Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+ SO2↑

　　褐紅色藍(lán)綠色

　　當(dāng)土壤中有機(jī)質(zhì)分解完畢，碳質(zhì)被氧化后，消煮液則呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色即“清亮”，因此硫酸銅不僅起催化作用，也起指示作用。同時(shí)應(yīng)該注意開氏法剛剛清亮并不表示所有的氮均已轉(zhuǎn)化為銨，有機(jī)雜環(huán)態(tài)氮還未完全轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，因此消煮液清亮后仍需消煮一段時(shí)間，這個(gè)過程叫“后煮”。

　　消煮液中硫酸銨加堿蒸餾，使氨逸出，以硼酸吸收之，然后用標(biāo)準(zhǔn)酸液滴定之。

　　蒸餾過程的反應(yīng)：

　　(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH3+2H2O

　　NH3+H2O→NH4OH

　　NH4OH+H3BO3→NH4·H2BO3+H2O

　　滴定過程的反應(yīng)：

　　2NH4·H2BO3+ H2SO4→(NH4)2SO4+ H2O

　　2.2主要儀器

　　消煮爐、半微量定氮蒸餾裝置(圖4-2)、半微量滴定管(5mL)。

　　2.3試劑

　　(1)硫酸。 ρ=1.84g·mL-1，化學(xué)純;

　　(2)10mol·L-1NaOH溶液。稱取工業(yè)用固體NaOH420g，于硬質(zhì)玻璃燒杯中，加蒸餾400mL溶解，不斷攪拌，以防止燒杯底角固結(jié)，冷卻后倒入塑料試劑瓶，加塞，防止吸收空氣中的CO2，放置幾天待Na2CO3沉降后，將清液虹吸入盛有約160mL無CO2的水中，并以去CO2的蒸餾水定容1L加蓋橡皮塞。

　　(3)甲基紅—溴甲酚綠混合指示劑。0.5g溴甲酚綠和0.1g甲基紅溶于100mL乙醇中(注1)。

　　(4)20g·L-1 H2BO3—指示劑。20g H2BO3(化學(xué)純)溶于1L水中，每升H2BO3溶液中加入甲基紅—溴甲酚綠混合指示劑5mL并用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)至微紫紅色，此時(shí)該溶液的pH為4.8。指示劑用前與硼酸混合，此試劑宜現(xiàn)配，不宜久放。

　　(5)混合加速劑。K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4(化學(xué)純)、10g CuSO4 ·5H2O(化學(xué)純)、和1g Se粉混合研磨，通過80號(hào)篩充分混勻(注意戴口罩)，貯于具塞瓶中。消煮時(shí)每毫升H2SO4加0.37g混合加速劑。

　　(6)0.02 mol·L-1(1/2 H2SO4)標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取H2SO4(化學(xué)純、無氮、ρ=1.84g·mL-1)2.83mL，加水稀釋至5000mL，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿或硼砂標(biāo)定之。

　　(7)0.01 mol·L-1(1/2 H2SO4)標(biāo)準(zhǔn)液。將0.02 mol·L-1(1/2 H2SO4)標(biāo)準(zhǔn)溶液用水準(zhǔn)確稀釋一倍。

　　(8)高錳酸鉀溶液。25g高錳酸鉀(分析純)溶于500mL無離子水，貯于棕色瓶中。

　　(9)1:1硫酸(化學(xué)純、無氮、ρ=1.84g·mL-1)。硫酸與等體積水混合。

　　(10)還原鐵粉。磨細(xì)通過孔徑0.15mm(100號(hào))篩。

　　(11)辛醇。

　　2.4測(cè)定步驟

　　(1)稱取風(fēng)干土樣(通過孔徑0.149mm篩)1.0000g[含氮約1mg(注2)]，同時(shí)測(cè)定土樣水分含量。

　　(2)土樣消煮

　�、俨话ㄏ鯌B(tài)氮和亞硝態(tài)氮的消煮：將土樣送入干燥的開氏瓶(或消煮管)底部，加少量無離子水(0.5～1mL)濕潤(rùn)土樣后(注3)，加入加速劑2g和濃硫酸5mL，搖勻，將開氏瓶?jī)A斜置于300W變溫電爐上，用小火加熱，待瓶?jī)?nèi)反應(yīng)緩和時(shí)(10～15min)，加強(qiáng)火力使消煮的土液保持微沸，加熱的部位不超過瓶中的液面，以防瓶壁溫度過高而使銨鹽受熱分解，導(dǎo)致氮素?fù)p失。消煮的溫度以硫酸蒸氣在瓶頸上部1/3處冷凝回流為宜。待消煮液和土粒全部變?yōu)榛野咨詭ЬG色后，再繼續(xù)消煮1h。消煮完畢，冷卻，待蒸餾。在消煮土樣的同時(shí)，做兩份空白測(cè)定，除不加土樣外，其他操作皆與測(cè)定土樣相同。

　�、诎ㄏ鯌B(tài)氮和亞硝態(tài)氮的消煮：將土樣送入干燥的開氏瓶(或消煮管)底部，加高錳酸鉀溶液1mL，搖動(dòng)開氏瓶，緩緩加入1:1硫酸2 mL，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)開氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通過長(zhǎng)頸漏斗將0.5g(±0.01g)還原鐵粉送入開氏瓶底部，瓶口蓋上小漏斗，轉(zhuǎn)動(dòng)開氏瓶，使鐵粉與酸接觸，待劇烈反應(yīng)停止時(shí)(約5min)，將開氏瓶置于電爐上緩緩加熱45min(瓶?jī)?nèi)土液應(yīng)保持微沸，以不引起大量水分丟失為宜)。停火，待開氏瓶冷卻后，通過長(zhǎng)頸漏斗加加速劑2g和濃硫酸5mL，搖勻。按上述①的步驟，消煮至土液全部變?yōu)辄S綠色，再繼續(xù)消煮1h。消煮完畢，冷卻，待蒸餾。在消煮土樣的同時(shí)，做兩份空白測(cè)定。

　　(3)氨的蒸餾

　�、僬麴s前先檢查蒸餾裝置是否漏氣，并通過水的餾出液將管道洗凈。

　�、诖笠豪鋮s后，用少量無離子水將消煮液定量地全部轉(zhuǎn)入蒸餾器內(nèi)，并用水洗滌開氏瓶4～5次(總用水量不超過30～35mL)。若用半自動(dòng)式自動(dòng)定氮儀，不需要轉(zhuǎn)移，可直接將消煮管放入定氮儀中蒸餾。

　　于150mL錐形瓶中，加入2020H2BO3—指示劑混合液5mL(注4)，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上3～4cm處(注5)。然后向蒸餾室內(nèi)緩緩加入10 mol·L-1NaOH溶液20 mL，通入蒸汽蒸餾，待餾出液體積約50mL時(shí)，即蒸餾完畢。用少量已調(diào)節(jié)至pH 4.5的水洗滌冷凝管的末端。

　�、塾玫味s出液由藍(lán)綠色至剛變?yōu)榧t色。記錄所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)。空白測(cè)定所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，一般不得超過0.4mL。

　　2.5結(jié)果計(jì)算

　　土壤全氮(N)量(g·kg-1)=

　　式中：V——滴定試液時(shí)所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);

　　V0——滴定空白時(shí)所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);

　　c——0.01 mol·L-1(1/2 H2SO4)或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度;

　　14.0——氮原子的摩爾質(zhì)量(g·mol-1);

　　10-3——將mL換算為L(zhǎng);

　　m——烘干土樣的質(zhì)量(g)。

　　兩次平行測(cè)定結(jié)果允許絕對(duì)相差：土壤全氮量大于1.0 g·kg-1時(shí)，不得超過0.005%;含氮1.0～0.6 g·kg-1時(shí)，不得超過0.004%;含氮<0.6 g·kg-1時(shí)，不得超過0.003%。

　　注釋：

　　注1.對(duì)于微量氮的滴定還可以用另一更靈敏的混合指示，即0.099g溴甲酚綠和0.066g甲基紅溶于100mL乙醇中。如要配制成20g·L-1 H2BO3—指示劑溶液：稱取硼酸(分析純)20g溶于約950mL水中，加熱攪動(dòng)直至H2BO3溶解，冷卻后，加入混合指示劑20mL混勻，并用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)至紫紅色(pH約5)，加水稀釋至1L混勻備用。宜現(xiàn)配。

　　注2.一般應(yīng)使樣品中含氮量為1.0～2.0mg，如果土壤含氮量在2 g·kg-1以下，應(yīng)稱土樣1g;含氮量在2.0～4.0 g·kg-1者，應(yīng)稱土樣0.5～1.0g;含氮量在4.0g·kg-1以上，應(yīng)稱土樣0.5g。

　　注3.開氏法測(cè)定全氮樣品必須磨細(xì)通過100孔篩，以使有機(jī)質(zhì)能充分被氧化分解，對(duì)于粘質(zhì)土壤樣品，在消煮前須先加水濕潤(rùn)使土粒和有機(jī)質(zhì)分散，以提高氮的測(cè)定效果。但對(duì)于砂質(zhì)土壤樣品，用水濕潤(rùn)與否并沒有顯著差別。

　　注4.硼酸的濃度和用量以能滿足吸收NH3為宜，大致可按每亳升10g·L-1 H2BO3能吸收氮(N)量為0.46mg計(jì)算，例如20 g·L-1 H2BO3溶液5mL最多可吸收的氮(N)量為5×2×0.46=4.6mg。因此，可根據(jù)消煮液中含氮量估計(jì)硼酸的用量，適當(dāng)多加。

　　注5.在半微量蒸餾中，冷凝管口不必插入硼酸液中，這樣可防止倒吸減少洗滌手續(xù)。但在常量蒸餾中，由于含氮量較高，冷凝管須插入硼酸溶液，以免損失。

土壤全氮量的測(cè)定

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