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杜馬斯燃燒法與凱氏法測定飼料含氮量的比較

　　摘要：文章以20種常見的飼料原料和2種化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物為試驗(yàn)材料，分別采用凱氏法和杜馬斯燃燒法測定各飼料樣本中的含氮量，并將其中11種樣本分別送往3個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凱氏法和杜馬斯燃燒法的測定，分析誤差來源，以確立一種快速無污染的飼料含氮量測定方法。結(jié)果表明，兩種測定方法呈顯著線性相關(guān)(r=0.9998，P<0.001)，而且大部分蛋白質(zhì)飼料和能量飼料的含氮量測定值間沒有差異(P>0.05),變異系數(shù)(CV)<5%，但在測定羊草、小麥秸、玉米秸和稻草時(shí)，兩種方法的測定值間存在顯著差異(P<0.05，CV<5%)。在3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室使用凱氏法測定時(shí)，7種樣本間存在顯著差異(P<0.05)，其中2種樣本的CV大于5%;而使用燃燒法時(shí)，只有2種樣本存在顯著差異(P<0.05)，并且所有樣本的實(shí)驗(yàn)室間CV均小于5%。11種飼料樣本在3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室間測定值的平均CV值表現(xiàn)為燃燒法明顯小于(P<0.01)凱氏法。

　　關(guān)鍵詞：飼料、含氮量、杜馬斯燃燒法、凱氏定氮法

　　粗蛋白含量是衡量飼料原料和動物產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)，因此，準(zhǔn)確測定動物飼料及其產(chǎn)品中的粗蛋白含量是動物飼養(yǎng)和營養(yǎng)的核心內(nèi)容之一。100多年前，凱氏定氮法就被應(yīng)用于測定各種物質(zhì)中的含氮量[1]。但由于凱氏法的測定耗時(shí)長，并且需要使用危險(xiǎn)化學(xué)試劑，易造成環(huán)境污染，危害人類健康，因而隨著氮元素分析設(shè)備的不斷改進(jìn)，杜馬斯燃燒法逐漸替代傳統(tǒng)的凱氏定氮法，用于測定動物飼料[2～4]、肉類制品[5]、谷物籽實(shí)和含油種子[6], 液態(tài)奶[7]中的含氮量。其測定原理是待測樣本在純氧(≥99.99%)環(huán)境中高溫燃燒，將其所含的有機(jī)氮和無機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化成氮的氧化物后被還原劑還原成氮?dú)�。最后，用TC檢測器檢測氮?dú)猱a(chǎn)量�；诖嗽�，杜馬斯燃燒法不僅能夠在4～6分鐘內(nèi)準(zhǔn)確地測定出樣品的總氮含量，而且還能測定出凱氏法所不能測定的飼料硝態(tài)氮。

　　杜馬斯燃燒法已經(jīng)被美國、德國、英國、日本等發(fā)達(dá)國家采用，作為飼料粗蛋白含量的官方測定方法。但是，在眾多的發(fā)展中國家，利用杜馬斯燃燒法測定各種飼料和飼糧中含氮量還很少。隨著人們對環(huán)境和健康問題的日益關(guān)注，常規(guī)凱氏法測定飼料含氮量所帶來的酸堿廢物污染問題促使人們尋找新的方法代替凱氏法。本研究設(shè)計(jì)2個(gè)試驗(yàn)，分別采用杜馬斯燃燒法和凱氏法測定多種飼料原料中的含氮量，并分析誤差來源，為杜馬斯燃燒法的利用提供科學(xué)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1樣本來源和處理方法

　　選取20種飼料原料和2種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)試劑為樣本，其中包括5種粗飼料(玉米秸、玉米青貯、羊草、小麥秸、稻草)，6種能量精料(玉米、小麥麩、小麥、大麥、高粱、大豆皮)，9種蛋白質(zhì)飼料(大豆粕、菜粕、棉粕、血粉、羽毛粉、魚粉、DDGS、酵母、尿素)以及硝酸銨和EDTA。所有樣本均在70℃烘箱內(nèi)干燥72h。用錘片式粉碎機(jī)粗粉碎(孔徑約2mm)后再用旋風(fēng)磨(0.5mm篩)進(jìn)一步粉碎，并置于封口塑料袋中，分別用杜馬斯燃燒法和凱氏法測定其含氮量。

　　1.2測定方法

　　1.2.1凱氏法: 稱取一定量的飼料樣品(粗飼料0.8g,蛋白質(zhì)飼料和能量飼料0.6 g)于消化管中，加入催化劑(3.5gK2SO4,0.4gCuSO4)，并注入10ml濃硫酸，在200℃下消化1h后升溫到400℃持續(xù)3小時(shí)，至消化液變澄清為止。利用自動蒸餾器在添加40%氫氧化鈉溶液(40ml)后蒸餾5min，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定硼酸吸收液。

　　1.2.2杜馬斯燃燒法: 采用氮素自動分析儀完成。稱取0.2g飼料樣品包于特制錫箔中，并置于自動落樣器上。樣品落入燃燒反應(yīng)爐(960℃)后，在通氧量為170ml/min的高純氧(≥99.99%)中充分燃燒300秒，直至氧剩余量達(dá)到12%時(shí)停止燃燒。燃燒反應(yīng)爐中的試劑依次為280g氧化銅，13g銀絲，15g鉑。燃燒爐中的產(chǎn)物(NOx)被載氣CO2運(yùn)送至還原爐(800℃)中，經(jīng)銅針和鎢還原生成的氮?dú)獬ニ�，進(jìn)入TCD檢測器檢測。測定結(jié)果由計(jì)算機(jī)自動輸出和打印。

　　1.3 不同實(shí)驗(yàn)室測定

　　將11種飼料樣本分別按1、2…..11編號，分別送某大學(xué)和某研究所進(jìn)行凱氏法含氮量盲測，各實(shí)驗(yàn)室所用的儀器均為凱氏自動定氮儀。同時(shí)，將按上述編號的11份樣本分別送杜馬斯儀器廠家2個(gè)實(shí)驗(yàn)室和本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行杜馬斯燃燒法氮素含量測定，所用儀器為德國生產(chǎn)的自動氮素分析儀。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)分析

　　利用SAS[8]統(tǒng)計(jì)軟件(SAS, 1996)中的廣義線性模型(GLM)進(jìn)行方差分析和多重比較(SNK)�；貧w分析采用REG模型，并對相關(guān)系數(shù)和截距進(jìn)行t 檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 杜馬斯燃燒法與凱氏法測定飼料含氮量結(jié)果的比較

　　表1列出了分別用凱氏法和杜馬斯燃燒法測定20種飼料原料和2種化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物中含氮量的結(jié)果。由表可見，隨飼料種類的不同，兩種方法測定值間的差異有所變化。雖然在測定能量飼料時(shí)兩種方法變異性不大(P>0.05, C/K=0.99～1.04)，但在5種粗飼料中，玉米秸、羊草、小麥秸和稻草的測定結(jié)果之間都存在顯著差異(P<0.05)，燃燒法的測定值高于凱氏法(D/K=1.06～1.21)。根據(jù)Watson[9]報(bào)道，這可能與粗飼料和秸稈中的硝態(tài)氮含量有關(guān)，而且本試驗(yàn)硝酸銨測定值之間的顯著性差異(P=0.001)也進(jìn)一步說明了這個(gè)問題。青貯玉米秸的測定值間不存在顯著差異(P=0.1559)，這也證實(shí)了Ataku[10]和Spoelstra[11]關(guān)于飼料原料在青貯過程中硝酸鹽含量會降低的觀點(diǎn)。大部分蛋白質(zhì)飼料差異不顯著(P>0.05),菜粕測定值之間的差異可能來源于其SEM較小，魚粉和DDGS測定值的變化可能與微生物作用產(chǎn)生腐胺和尸胺有關(guān)。從總體上看，兩種方法的變異系數(shù)均小于5%，如圖1所示測定值間呈顯著線性相關(guān)(r=0.9998,P<0.001)，擬合直線與Y=X重合性好，截距呈顯著相關(guān)(P<0.05)。大部分飼料的燃燒法測定值略高于凱氏法(圖 2)，其中在測定能量飼料時(shí)，兩種方法的差值最小，這可能與飼料中硝態(tài)氮含量低有關(guān)。在蛋白質(zhì)飼料中，尿素的凱氏法測定值略高于燃燒法(P>0.5)，這可能與尿素在燃燒法測定時(shí)的不完全燃燒有關(guān)。全部22種含氮物質(zhì)的平均變異系數(shù)凱氏法顯著高于(P<0.05)杜馬斯燃燒法。因此，杜馬斯燃燒法完全能夠替代凱氏法用于測定飼料的含氮量。

　　同行平均數(shù)具有不同肩標(biāo)字母者差異顯著(P<0.05)。下同

　　CV2表示變異系數(shù)。C/K3表示燃燒法與凱氏法的比值。

　　2.2 兩種方法的實(shí)驗(yàn)室誤差

　　盡管杜馬斯燃燒法與凱氏法的飼料含氮量測定值之間呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，而且大部分飼料的燃燒法測定值高于凱氏法，但兩種方法的分析誤差大小更為人們所關(guān)心。表2列出了3個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別采用凱氏法和杜馬斯燃燒法測定11種樣本的含氮量結(jié)果。結(jié)果表明，采用凱氏法測定時(shí)，11種飼料中有7種飼料樣本的不同實(shí)驗(yàn)室測定值間存在顯著差異(P<0.05)，其中有2種樣本的實(shí)驗(yàn)室測定值間變異系數(shù)大于5%(圖3);而使用杜馬斯燃燒法時(shí)，只有2種樣本含氮量測定值存在顯著差異(P<0.05)，而且所有樣本的實(shí)驗(yàn)室測定值間變異系數(shù)均小于5%(圖3)。11種飼料樣本含氮量測定值在不同實(shí)驗(yàn)室間的平均變異系數(shù)表現(xiàn)為杜馬斯燃燒法(CV = 1.037)明顯小于(P<0.01)凱氏法(CV = 3.138;圖3)。這種實(shí)驗(yàn)室間飼料含氮量結(jié)果的差異說明，飼料含氮量的測定方法有待于進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。利用凱氏法測定時(shí)，由于其前處理過程步驟多，不同類型的消化設(shè)備、蒸餾設(shè)備、滴定儀器均會導(dǎo)致測定值間的顯著性差異;但杜馬斯燃燒法測定過程操作簡單，儀器自動化程度高，測定時(shí)間短(測定全過程只需4~6分鐘)，因此該方法的重現(xiàn)性明顯優(yōu)于凱氏法。

　　　　3. 結(jié)論

　　杜馬斯燃燒法測定的反芻動物飼料含氮量結(jié)果與常規(guī)凱氏法具有高度相關(guān)性，且測定青粗飼料時(shí)其結(jié)果高于凱氏法，可能與燃燒法能夠測定該飼料中硝態(tài)氮有關(guān)。對于飼料樣本含氮量測定值在不同實(shí)驗(yàn)室之間的平均變異系數(shù)來說，凱氏法顯著高于杜馬斯燃燒法。與凱氏法相比，杜馬斯燃燒法不僅能夠在更短的時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確測定反芻動物飼料和飼糧總氮含量，而且還能減少對環(huán)境的污染以及對人類健康的危害。杜馬斯燃燒法可以作為測定各種飼料和飼糧含氮量的常規(guī)方法。

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杜馬斯燃燒法與凱氏法測定飼料含氮量的比較

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