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⑴ 了解液相色譜的原理和應(yīng)用

⑵ 握標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法

二、實驗原理：

咖啡因又稱咖啡堿，屬黃嘌呤衍生物，化學(xué)名稱1,3,7-三甲基黃嘌呤，可由茶葉或咖啡中提取而得的一種生物堿。它能興奮大腦皮層，使人精神興奮。咖啡中含咖啡因1.2%-1.8%，茶葉約含2.0%-4.7%�？蓸�、APC藥片中均含有咖啡因。其分子式為C8H10O2N4，結(jié)構(gòu)式：

樣品在堿性條件下，用氯仿定量提取，采用反相液相色譜柱進(jìn)行分離，以紫外檢測器進(jìn)行檢測，以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對其濃度作工作曲線，再根據(jù)樣品中的咖啡因面積，由工作曲線算出濃度。

三、 實驗儀器與藥品

⑴儀器

LC7000液相色譜儀 Clarity工作站 色譜柱(EconosphereC18) 平頭微量進(jìn)樣器

⑵藥品

① 甲醇(色譜純) 雙蒸水 氯仿(A.R) 1mol/LNaOH;NaCl(A.R.) Na2SO4(A.R.)

咖啡因(A.R.) 可口可樂(1.25L瓶裝) 雀巢咖啡 茶葉

②1000mg/L咖啡因儲備液 將咖啡因在110℃下烘干1小時，準(zhǔn)確稱取0.1000g咖啡因，用氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度。

四、實驗步驟：

⑴ 色譜條件：

柱溫：室溫

流動相：甲醇/水=60：40

流量：1.0mL/min

檢測波長：275nm

⑵ 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制：分別用吸量管吸取0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40mL咖啡因儲備液于六只容量瓶中，用氯仿定容至刻度，濃度分別為40、60、80、100、120、140mg/L

⑶ 樣品處理：

①將100mL可口可樂置于250mL燒杯中，劇烈攪拌30min或用超聲波脫氣5min，以趕凈二氧化碳。

②準(zhǔn)確稱取咖啡0.25g，用水溶解定容至100mL。

③準(zhǔn)確稱取茶葉0.3g,加蒸餾水30mL煮沸10min，冷卻后將清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，并按此操作重復(fù)兩次，定容至刻度。將3份樣品溶液分別進(jìn)行干過濾，棄去前過濾液，取后面的過濾液。

④分別取上述三份樣品溶液25.0mL于125mL分液漏斗中，加飽和氯化鈉溶液，溶液，然后用氯仿分三次萃取。將氯仿提取液分離后經(jīng)裝有無水硫酸鈉小漏斗，過濾至容量瓶中，最后用少量氯仿多次洗滌小漏斗，定容至刻度。

⑷繪制工作曲線：待液相色譜儀基線平直后，分別注入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10μl，重復(fù)兩次，要求兩次所得的咖啡因色譜峰面積基本一致，記下峰面積與保留時間。

⑸樣品測定：分別注入樣品溶液10μl，根據(jù)保留時間確定樣品中咖啡因色譜峰的位置，重復(fù)兩次，記下咖啡因色譜峰峰面積。

五、結(jié)果處理：

⑴根據(jù)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜圖，繪制咖啡因峰面積與其濃度的關(guān)系曲線。

⑵根據(jù)樣品中咖啡因色譜峰的峰面積，由工作曲線計算可口可樂、咖啡、茶葉中咖啡因含量(分別用mg/L、mg/g和mg/g表示)

六、注意事項：

⑴液體樣品必須經(jīng)過萃取處理，不能直接進(jìn)樣，雖然操作簡單，但會影響色譜柱的壽命。

⑵不同牌號的茶葉、咖啡中咖啡因含量不大相同，稱取樣品可酌量增減。

⑶若樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液需要保存，應(yīng)置于冰箱。

⑷樣品和標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)樣量要嚴(yán)格保持一致。